近日節律紊亂對小鼠海馬神經元結構和功能的影響*

黃昶荃　李永紅　關俊文　劉清秀

(1.綿陽市第三人民醫院老年綜合科，四川 綿陽　621000；2.成都信息工程大學，四川 成都　610103；3.四川大學華西醫院，四川 成都　610041)

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論著

近日節律紊亂對小鼠海馬神經元結構和功能的影響*

黃昶荃1李永紅2關俊文3劉清秀1

(1.綿陽市第三人民醫院老年綜合科，四川 綿陽621000；2.成都信息工程大學，四川 成都610103；3.四川大學華西醫院，四川 成都610041)

摘要目的：用不規律光暗循環建立小鼠近日節律紊亂動物模型，觀察近日節律紊亂對小鼠海馬神經元結構和功能的影響。方法：將40只雄性ICR小鼠(8-10 周齡，體質量18-20 g)隨機分成節律正常組和節律紊亂組，每組20只。節律正常組給予光照12小時和12小時黑暗。節律紊亂組給予光照3小時和黑暗5小時與光照5小時和黑暗3小時交替。6個月后，水迷宮測小鼠的認知功能、電生理技術觀測海馬長時程增強(Long-term potentiation，LTP)現象、電鏡檢測小鼠海馬細胞的超微結構。結果：與節律正常組比較，節律紊亂組小鼠逃避潛伏時間顯著延長、穿越中心區域次數顯示中央區次數顯著減少(P<0.05)。節律紊亂組小鼠海馬突觸結構模糊，突觸前、后膜軸漿溶解，突觸小泡明顯減少，突觸后膜腫脹，變薄，突觸間隙變窄，海馬突觸LTP發生率和峰值均顯著降低(P<0.05)。結論：近日節律紊亂可導致小鼠海馬神經元結構破壞、神經傳導功能下降、小鼠認知功能受損。

關鍵詞：近日節律；海馬結構和功能；認知功能

生物體內存在以近24小時周期的生物節律，哺乳動物都證明其節律可以被光暗循環(LD循環)所導引[1-3]。現已明確近日節律紊亂將導致動物的認知功能受損，但其機制還不完全清楚[4]。本研究用LD循環3/5和5/3建立節律紊亂模型，檢測小鼠的海馬的電鏡超微結構、海馬神經元突觸傳遞的長時程增強(Long-term potentiation，LTP)和學習記憶能力，以明確近日節律紊亂導致認知功能受損及其機制。

1材料與方法

1.1動物分組及處理

40只雄性ICR小鼠(8-10周齡，體重18-20 g左右)先適應LD 12/12(光照12 h，黑暗12 h)光暗循環2周，再隨機分為節律正常組和節律紊亂組，每組 20只。節律正常組和節律紊亂組分別在LD12/12和LD3/5(光照3 h，黑暗5 h)和5/3光照5 h，黑暗3 h)交替下飼養6個月。

1.2水迷宮測試

應用 Morris水迷宮測試小鼠的空間學習記憶情況，包括定位航行實驗、記憶保留實驗、空間探索實驗和可見平臺實驗。

1.3海馬神經元突觸超微結構檢測

水迷宮實驗完成兩天后，隨機取各組小鼠5只，斷頭處死，迅速取出雙側海馬，切取1 mm3組織塊迅速放入4℃ 2.5 %的戊二醛中固定，24 h后洗凈，再二次固定于1%的四氧化鋨60 min。酒精梯度脫水，丙酮酸置換，浸透，Epon812包埋，聚合，制成超薄切片，酸雙氧鈾，檸檬酸鉛復染。透射電鏡下觀察海馬神經元超微結構。

1.4海馬長時程增強(Long-term potentiation, LTP)現象

小鼠斷頭處死后，取出一側海馬，順海馬槽纖維的走向連續切片，片厚400-500 μm。迅速將其移至浴槽尼龍網上，隨之保證持續的恒溫人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid，ACSF)灌流。腦片的供氧以界面式進行。即讓95%O2與5%CO2的混合氣體通過外室熱水加熱、濕化再彌散于腦片的表面，供氧量為1dl·min-1。腦片在孵育0.5 h后，開始灌注含Fluo-3(AM)的ACSF。Fluo-3的濃度為40 μmol·L-1。灌流1 h，灌流量約1～1.5 ml，采用間歇灌流方式。標記完畢后用ACSF沖洗0.5 h，隨后開始電生理記錄。本實驗刺激電極置于來自CA3區錐體細胞的Schaffer側枝上，記錄電極置于CA1區的放射層，所記錄的電活動是Schaffer側枝CA1區錐體細胞的場興奮性突觸后電位(Field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)。記錄時，先行測試刺激(Test stimulation，TS)，測試刺激每5～10 min一次。以觀察fEPSP是穩定，待其穩定15 min后，再行條件刺激(Conditioning stimulation，CS)。條件刺激10 min后，檢測LTP是否產生。檢測LTP后，取出腦片立即進行激光共聚焦顯微鏡觀察。觀察時注意調整聚焦平面，以獲取最佳效果。

1.5統計學方法

采用SPSS15.0統計學軟件對數據進行統計處理，計數資料采用X2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05具有統計學意義。

2結果

2.1小鼠學習記憶能力

節律紊亂組避潛伏時間顯著長于節律正常組(P<0.05)，穿越中心次數顯著少于節律正常組(P<0.05)。表明節律紊亂組小鼠的學習記憶能力顯著減退，見表1。

表1　各組小鼠morris水迷宮測試結果

注：與正常組比較，*P<0.05。

2.2小鼠海馬突觸超微結構改變

電鏡下節律正常組小鼠海馬突觸前后結構清晰，突觸前膜小泡，突觸間隙清晰可見。節律紊亂組小鼠海馬突觸結構模糊，突觸前、后膜軸漿溶解，突觸小泡明顯減少，突觸后膜腫脹、變薄、突觸間隙變窄。

2.3小鼠離體腦片海馬LTP

小鼠離體腦片電生理技術檢測海馬LTP檢測結果顯示節律紊亂組小鼠LTP發生率和LTP發生的高峰值顯著低于節律正常組，見表2。

表2　近日節律正常與光暗循環紊亂小鼠離海馬LTP比較±SD，n=15)

注：與正常組比較，*P<0.05。

3討論

本研究用不同規則光暗循環建立近日節律紊亂小鼠的動物模型，探討近日節律紊亂導致認知功能可能受損及其機制。結果顯示，近日節律紊亂小鼠學習記憶能力減退，存在一定的認知功能受損，同時近日節律紊亂海馬神經元突觸結構受損和海馬受刺激后發生的長程動作電位發生次數減少和LTP波幅降低。

輕度認知功能障礙(Mild Cognitive Impairment，MCI)是介于正常與癡呆之間的一種認知功能損害或過渡狀態。以記憶障礙為突出表現，可有其他認知功能的減退，但日常活動能力不受影響，未達到符合癡呆的診斷標準。近年報道認為其是阿爾茨海默病(AD)的超早期階段[6]。有文獻表明每年約10%～15%的MCI患者發展為癡呆[7]。因此，MCI可能是癡呆的高危因素。由于癡呆為不可逆損害，而MCI經積極治療可以改善患者生活質量，可能實現對老年癡呆的早期診斷及早期干預，成為近年來神經醫學領域研究的熱點。

生物體內存在以近24小時的周期變化的生物節律。現有的研究已經證實生物節律與認知功能關系密切，前期研究發現光/暗5/5、12/12(近日節律)和22/22h干預小鼠6月，12/12(近日節律)的學習記憶能力好于其他兩組。表明保持規律光照，但周期長短不同，近日節律(24小時為周期)狀態下學習記憶能力最好。本研究發現，指規律光照下，小鼠學習記憶能力顯然好于不規律率光照小鼠。

突觸是是神經傳遞結構，突觸前膜受刺激后突觸后膜的反應是顯示突觸后膜的長程電位活動是反映神經信息在不同神經元傳遞效率的指標。本文結果顯示以24小時為周期不規律光照誘導近日節律紊亂動物可損傷突觸的結構，導致海馬神經元間信息傳遞效率降低，進而導致動物的認知功能受損。

綜上所述，在不規律光照導致的近日節律紊亂的條件下，小鼠認知功能下降，海馬神經元信息傳遞結構受損和傳遞效率降低是造成該現象的重要原因之一。

參考文獻

1王正榮. 時間生物學[M]. 北京: 科技出版社出版. 2006, 1-2, 42-53, 63-82, 168-9, 288-304.

2Bonmati-Carrion MA, Arguelles-Prieto R, Martinez-Madrid MJ, et, al. Protecting the melatonin rhythm through circadian healthy light exposure[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 23448-23500.

3Zhu L, Zee PC. Circadian Rhythm Sleep Disorders[J]. Neurol Clin. 2012, 30(4): 1167-1191.

4Song H, Moon M, Choe HK, et al. Aβ-induced degradation of BMAL1 and CBP leads to circadian rhythm disruption in Alzheimer’s disease[J]. Mol Neurodegener, 2015, 10: 13-13.

5唐敬龍,高維娟,錢濤,等. 補陽還五湯對血管性癡呆小鼠海馬CA1區LTP及ERK2與CaMKIIβ mRNA表達的影響[J]. 中風與神經疾病雜志, 2013, 30(1): 17-19.

6Winblad B, Palmer K, Kivipelto M, et al. Mildcognitive impairment beyond controversies，towards a consensus：report of the International Working Group on mild cognitive impairment[J]. J Intern Med, 2004, 56(1): 27-35.

7Ronald C, Rachelle D, Alexander K, et, al. Current concepts in mild cognitive impairment[J]. Arch Neurol, 2001, 58(10): 1985-1992.

Influence of circadian disorder on structures and functions of neurons in hippocampus of mice*

Huang Chang-quan1, Li Yong-hong2, Guan Jun-wen3, Liu Qing-xiu1

(1.Department of Geriatrics, The Third People Hospital or Mianyang, Sichuan Mianyang 621000;2.Chengdu University of Information Technology, Sichuan Chengdu 610103;3.West China Hospital, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To study the influence of circadian disorder on structures and functions of neurons in hippocampus of mice. Methods: Forty male ICR (8-10 weeks of age, body mass 18-20 g) were randomly divided into rhythm disorder group and normal rhythm group. The rhythm disorder group was treated with 3 hours light/5 hours dark and 5 hours light/3 hours dark, alternately. The normal rhythm group was treated with 12 light and 12 dark. The intervention maintained six months. Electron microscope was used to detect the mouse hippocampal cell ultrastructure. Morris water maze was used to test mice cognitive function. The brain slice electric physiological techniques were used to detect synapses in the hippocampus LTP effect. Results: The time of escape latency of rhythm disorder group was longer than that of normal rhythm group. The times of through central area of rhythm disorder group was less than that of normal rhythm group. The structure of synapses of hippocampal cell of rhythm disorder group was fuzzy. The axoplasm in anterior-posterior membranes of synapses of rhythm disorder group was dissolved. The synaptic vesicles of rhythm disorder group were decreased. The posterior membranes of synapses of rhythm disorder group were swelled and attenuated. The incidence and crest value of LTP effect f rhythm disorder group were decreased. Conclusion: Circadian rhythm disorder induced by irregular light-dark circle can lead to the structural damage of hippocampal neurons, decrease nerve conduction function and damage the cognitive function in mice.

Key Words:Circadian rhythm; Structures and functions of neurons; Hippocampus; Cognitive function

*基金項目：四川省科技支撐計劃(編號：2010FZ0061，2013FZ0051)；四川省杰出青年基金(編號：2012JQ0050)

作者簡介：黃昶荃，男，研究員，主要從事老年醫學的臨床和科研工作，Email：18030990101@163.com。

(收稿日期：2016-5-8)