人參皂苷Rb1抑制間歇性高糖誘導的雪旺細胞凋亡

薛　冰，梁琳瑯，宋　威，孫連慶

?

人參皂苷Rb1抑制間歇性高糖誘導的雪旺細胞凋亡

薛冰1，梁琳瑯1，宋威1，孫連慶2*

1.沈陽軍區總醫院內分泌科，沈陽 110016；2.西安交通大學第一附屬醫院中醫科，西安 710061

[摘要]目的探討人參皂苷Rb1對間歇性高糖培養條件下雪旺細胞凋亡的影響。方法無菌剝取新生Sprague-Dawley乳鼠坐骨神經，體外制備雪旺細胞，分為對照組(培養液葡萄糖濃度為5.6 mmol/L，Con組)、間歇性高糖組(培養液葡萄糖濃度為5.6 mmol/L和50 mmol/L,每8小時交替，IHG組)、干預組(在間歇性高糖基礎上加入100 μmol/L人參皂苷Rb1，IHG+Rb1組)分別培養48 h。采用AnnexinV/PI雙染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡，ELISA法檢測8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，實時熒光定量PCR法檢測凋亡相關基因Bcl-2和Bax的mRNA表達，蛋白印跡法檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達。結果與對照組相比，間歇性高糖促進了雪旺細胞凋亡(P<0.05)，增加了8-OHdG的生成(P<0.01)，IHG組細胞凋亡率和8-OHdG水平分別是Con組的7.69倍、3.24倍；間歇性高糖上調了Bax的mRNA和蛋白表達，下調了Bcl-2的mRNA和蛋白表達。與IHG組相比，人參皂苷Rb1抑制了IHG導致的雪旺細胞凋亡和8-OHdG生成，IHG+Rb1組細胞凋亡率和8-OHdG水平較IHG組分別下降了54.1%和32.7%(P<0.05)；同時下調了Bax的mRNA和蛋白表達，上調了Bcl-2的mRNA和蛋白表達(P<0.05)。結論間歇性高糖可促進雪旺細胞凋亡，人參皂苷Rb1能夠減輕間歇性高糖造成的凋亡，具有一定的神經保護作用。

[關鍵詞]人參皂苷Rb1;雪旺細胞;凋亡

0引言

糖尿病周圍神經病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者最常見的慢性并發癥，嚴重影響患者的生活質量和壽命[1]。DPN的發病機制十分復雜，其主要病理基礎是高血糖，但連接這一代謝紊亂和各種病理生理改變的確切機制尚不完全清楚。已有研究顯示，高糖狀態，尤其是間歇性高糖(Intermittent high glucose，IHG)，通過誘發線粒體產生過度氧化應激、促發神經元及神經膠質細胞凋亡，造成神經損傷[2]。雪旺細胞是周圍神經系統特有的功能細胞，但是目前關于雪旺細胞在間歇性高糖條件下的功能變化及機制研究并不多見。本研究通過體外培養雪旺細胞，觀察間歇性高糖條件下以及給予人參皂苷Rb1干預后凋亡相關指標的變化，探討人參皂苷Rb1改善神經細胞損傷的可能機制。

1材料

1.1實驗動物出生3 d的Sprague-Dawley乳鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，合格證號[SCXK(京)2007-0001]。

1.2主要儀器與試劑HERAcell細胞培養箱(德國Heraeus公司)，DU640型分光光度計(美國Backman公司)，FACSAsia流式細胞儀(美國BD公司)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)，SLAN熒光定量PCR檢測系統(上海宏石醫療科技公司)。胎牛血清及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，葡萄糖、G-418、DMEM培養基(美國Gibco公司)，人參皂苷Rb1(上海欣博盛生物科技公司)，兔抗鼠S-100多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒和HRP標記的二抗(北京中杉金橋公司)，DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(北京嘉美生物公司)，大鼠8-OHdG ELISA檢測試劑盒(加拿大StressMarq生物科學公司)，cDNA合成試劑盒和SYBR預混試劑盒(美國Invitrogen公司)，兔抗鼠Bcl-2、Bax、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。

2方法

2.1雪旺細胞的培養、純化和鑒定脫頸處死Sprague-Dawley乳鼠，無菌分離并切取雙側坐骨神經，仔細剝離神經外膜，盡量去除束膜，用D-Hank′s液漂洗后，將神經組織剪碎至0.5～1 mm2，均勻接種于T25培養瓶內，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，采用差速貼壁法、低濃度胰酶消化(0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)加100 μg/mL G418純化并傳代培養。選取第3代生長良好的細胞，消化制成單細胞懸液，按1×105/孔的密度接種到預置有蓋玻片的6孔板內繼續培養，待細胞生長成單層時，取出蓋玻片，進行S-100蛋白免疫組化鑒定。

2.2實驗分組結合本課題組的前期工作基礎，分別以5.6 mmol/L、50 mmol/L為正常葡萄糖、高葡萄糖濃度，以100 μmol/L人參皂苷Rb1進行藥物干預。將生長良好的雪旺細胞按照1×106/mL密度接種于培養瓶中，待細胞均勻鋪滿瓶底后，按以下條件分組繼續培養48 h。實驗分組如下：①對照組(Con組)：DMEM培養基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L葡萄糖；②間歇性高糖組(IHG組)：DMEM培養基+20%大鼠血清+5.6 mmol/L或50 mmol/L葡萄糖，每8小時交替換液1次；③干預組(IHG+Rb1組)：在IHG培養基礎上加入終濃度100 μmol/L人參皂苷Rb1。

2.3雪旺細胞凋亡的檢測分組收集細胞，PBS洗滌2次，加入400 μL結合緩沖液懸浮細胞。加入Annexin V/FITC和PI各5 μL后混勻，室溫下避光反應10 min，采用流式細胞儀檢測熒光強度，每組計數1×104個細胞，激發波長488 nm，發射波長530 nm。

2.4雪旺細胞8-OHdG水平的檢測分別提取細胞總DNA，采用分光光度計檢測定量，參照試劑盒操作說明檢測DNA樣本中8-OHdG水平。具體如下：用50 μL含有100 mmol/L乙酸鈉和5 mmol/L氯化鎂的反應混合液重懸200 μg DNA樣本，加入1 μL DNase室溫下消化10 min。取含有8-OHdG的微量滴定板,每孔加入50 μL的樣本或對照品，隨即每孔加入50 μL一抗，37 ℃孵育1 h。棄去孔中液體,振蕩洗滌30 s×3次，每孔加入100 μL二抗，搖晃混勻，37 ℃孵育30 min。棄去孔中液體,振蕩洗滌30 s×3次，每孔加入100 μL著色劑，混勻后避光、室溫下放置15 min。最后加入100 μL終止液，室溫放置2 min。應用酶標儀測定光密度值(波長450 nm)，繪制標準曲線，計算各樣本中的8-OHdG含量。

2.5雪旺細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達的檢測采用Trizol法提取細胞總RNA，電泳鑒定并定量，按照cDNA合成試劑盒操作說明逆轉錄合成cDNA，根據目的基因及擴增條件進行擴增。Bax (209 bp)：上游引物5′-GGCGAATTGGAGATGAACTG-3′，下游引物5′-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3′；Bcl-2 (225 bp)：上游引物5′-GCGTCAACAGGGAGATGTCA-3′，下游引物5′-GGTATGCACCCAGAGTGATG-3′；GAPDH (256 bp)：上游引物5′-TGTCTCCTGCGACTTCAACAG- 3′，下游引物5′-GAGGCCATGTAGGCCATGAG-3′。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃25 s，共40個循環。實驗重復3次，計算各組目的基因和GAPDH Ct值的差值(ΔCt)，以2-ΔΔCt表示目的基因與內參基因GAPDH的相對表達量。

2.6雪旺細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的檢測提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法定量并調整蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳后電轉至PVDF膜上，0.5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠Bax、Bcl-2、β-actin抗體(1∶200稀釋)4 ℃過夜，TBST洗滌，加入HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育90 min，ECL顯色，X線曝光顯影。Image Tool軟件測定光度值。

3結果

3.1雪旺細胞的形態及鑒定剪碎的神經組織貼壁后第2天即可觀察到有細胞從組織塊浮出。多數細胞呈梭形生長，細胞核為卵圓形，胞體較小且飽滿，有細長突起，呈雙極或多極，純化培養后細胞生長良好，聚集成網格狀或漩渦狀。S-100抗體免疫組化染色后雪旺細胞純度達95%以上。

3.2各組雪旺細胞凋亡率的比較與Con組相比，IHG組細胞凋亡率明顯增加，是Con組的7.69倍(P<0.01)。人參皂苷Rb1減輕了間歇性高糖引起的雪旺細胞凋亡，與IHG組相比，IHG+Rb1組細胞凋亡率明顯下降，較IHG組下降了54.1%(P<0.05)，結果見圖1。

圖1　各組雪旺細胞凋亡率的比較

3.3各組雪旺細胞8-OHdG水平的比較與Con組相比，IHG組雪旺細胞的8-OHdG水平明顯增加，是Con組的3.24倍(P<0.01)。人參皂苷Rb1抑制了間歇性高糖引起的雪旺細胞8-OHdG增高，同IHG組相比，IHG+Rb1組雪旺細胞的8-OHdG水平明顯減少，較IHG組減少了32.7%(P<0.05)，結果見圖2。

3.4各組雪旺細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達水平的比較與Con組相比，IHG組Bax mRNA表達水平明顯增高，是Con組的2.42倍(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，是Con組的46.2%(P<0.05)。人參皂苷干預拮抗了間歇性高糖對Bax和Bcl-2 mRNA表達水平的影響，同IHG組相比，IHG+Rb1組Bax mRNA表達水平下降為IHG組的73.2%(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達水平升高為IHG組的1.78倍(P<0.05)，結果見圖3。

圖2　各組雪旺細胞8-OHdG水平的比較

圖3　各組雪旺細胞Bax和Bcl-2 mRNA表達水平的比較

3.5各組雪旺細胞Bax 和Bcl-2蛋白表達水平的比較與Con組相比，IHG組Bax 蛋白表達水平明顯增高，是Con組的2.81倍(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，是Con組的36.7%(P<0.05)。人參皂苷干預逆轉了間歇性高糖對Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響，同IHG組相比，IHG+Rb1組Bax 蛋白表達水平下降為IHG組的49.1%(P<0.05)，Bcl-2 蛋白表達水平升高為IHG組的2.08倍(P<0.05)，結果見圖4。

4討論

糖尿病周圍神經病變的發病機制十分復雜，可能與多種因素有關，包括：糖脂代謝紊亂、神經缺血缺氧、多元醇通路異常、蛋白激酶C激活、非酶糖基化終產物形成、神經營養因子缺乏、氧化應激、炎癥、免疫機制異常等。其中，Brownlee[3]提出的糖尿病血管并發癥統一機制——氧化應激學說近年來備受關注：高糖引起組織細胞的線粒體超氧化物產生過多、促發氧化應激，并激活炎癥、凋亡等其他代謝途徑，是糖尿病慢性并發癥的共同發病機制。

圖4　各組雪旺細胞Bax和Bcl-2 蛋白表達水平的比較

雪旺細胞是周圍神經特有的髓鞘形成細胞，是DPN的主要靶細胞，在維持神經結構、功能以及修復神經損傷過程中起重要作用[4]。雪旺細胞內線粒體豐富，能量代謝旺盛，因而對高糖引起的氧化應激高度敏感。高糖可引起線粒體電子傳遞鏈超負荷、分裂形成片段，誘發ROS產生過量?；A和臨床研究表明，血糖過度波動對糖尿病血管并發癥的危害可能超過血糖絕對水平的作用，間歇性高糖比穩定性高糖更容易激活氧化應激反應，加劇包括DPN在內的糖尿病慢性血管并發癥的發生發展[5-6]。

氧化應激反應可通過堿基修飾、直接斷裂及改變核酸構象等方式造成DNA損傷，其中最主要的致突變性損傷反應是C-8上鳥嘌呤和胸腺嘧啶堿基的顛換突變，生成8-OHdG。8-OHdG是DNA氧化損傷主要的特異性的代謝終產物，只能通過DNA氧化損傷途徑形成，且可以在體內穩定存在，因此被公認為內源性及外源性因素造成DNA氧化損傷的標志物[7]。本研究將雪旺細胞在間歇性高糖條件下體外培養48 h，發現間歇性高糖可以明顯增加8-OHdG生成，促進了雪旺細胞內氧化應激。

氧化應激增加可以直接或間接損傷雪旺細胞線粒體膜的通透性，線粒體膜通透性轉運孔開放，線粒體跨膜電位下降，線粒體膜通透性增加，細胞色素酶C、凋亡誘導因子等致凋亡物質從線粒體膜間腔釋放，通過Caspase或非Caspase信號途徑引起細胞凋亡。Bcl-2蛋白可以調節線粒體膜通透性、減少促凋亡物質釋放，抑制凋亡發生。而在凋亡信號刺激下，胞漿中的Bax蛋白可以轉移至線粒體膜并與膜上的Bcl-2形成異源二聚體，改變Bcl-2構象并抑制其表達，從而促進凋亡發生。本研究顯示，間歇性高糖也影響了凋亡相關信號通路的調控，上調促凋亡因子Bax的mRNA和蛋白表達，下調凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA和蛋白表達，雪旺細胞凋亡率明顯增加。

人參皂苷Rb1是傳統中藥人參的主要活性組分之一，具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂等多種藥理作用。Wu等[8]發現，人參皂苷Rb1可以減輕糖尿病大鼠的心肌缺血/再灌注損傷，其心血管保護效應至少部分與激活PI3K/Akt信號通路有關。Tsai等[9]發現，人參皂苷Rb1具有促進受損的周圍神經再生修復的作用。Huang等[10]研究顯示，人參皂苷Rb1可以減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，抑制神經元凋亡。本研究在間歇性高糖條件下給予人參皂苷Rb1(根據前期實驗結果選擇100 μmol/L最佳濃度)進行干預，發現其可以抑制8-OHdG生成，降低雪旺細胞DNA氧化損傷，逆轉間歇性高糖引起的Bax mRNA和蛋白表達上調、Bcl-2 mRNA和蛋白表達下調，雪旺細胞凋亡率明顯減低。這說明人參皂苷Rb1對于間歇性高糖誘導的雪旺細胞損傷具有明顯的保護效應。

綜上所述，本研究初步顯示，間歇性高糖可以誘發神經細胞的DNA氧化損傷，促進細胞凋亡，提示合理控制血糖、避免血糖過度波動在DPN治療中的重要性。此外，對神經細胞氧化應激和凋亡相關通路的干預是糖尿病周圍神經病變防治的重要策略，人參皂苷Rb1可通過減輕雪旺細胞的DNA氧化損傷、減少凋亡而有助于DPN的防治。

參考文獻：

[1]Kim H,Kim JJ,Yoon YS.Emerging therapy for diabetic neuropathy:cell therapy targeting vessels and nerves[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2012,12(2):168-178.

[2]Figueroa RC,Sadidi M,Feldman EL.Mechanisms of disease:the oxidative stress theory of diabetic neuropathy[J].Rev Endocr Metab Disord,2008,9(4):301-314.

[3]Brownlee M.The pathology of diabetic complications:a unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625.

[4]Mizisin AP.Schwann cells in diabetic neuropathy[J].Advan Mol Cell Bio,2003,31(3):1105-1116.

[5]Zhang X，Xu X,Jiao X,et al.The effects of glucose fluctuation on the severity of coronary artery disease in type 2 diabetes mellitus[J].J Diabetes Res,2013,4:347-353.

[6]Cinci L,Corti F,Di Cesare Mannelli L,et al.Oxidative,metabolic,and apoptotic responses of Schwann cells to high glucose level[J].J Biochem Mol Toxicol,2015,29(6):274-279.

[7]Al-Aubaidy HA,Jelinek HF.Oxidative DNA damage and obesity in type 2 diabetes mellitus[J].Eur J Endocrinol,2011,164(6):899-904.

[8]Wu Y,Xia ZY,Dou J,et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats [J].Mol Biol Rep,2011,38(7):4327-4335.

[9]Tsai CC,Lu MC,Chen YS,et al.Locally administered nerve growth factor suppresses ginsenoside Rb1-enhanced peripheral nerve regeneration[J].Am J Chinese Med,2003,31(5):665-673.

[10]Huang F,Li YN,Yin F,et al.Ginsenoside Rb1 inhibits neuronal apoptosis and damage,enhances spinal aquaporin 4 expression and improves neurological deficits in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3565-3572.

Ginsenoside Rb1 inhibits apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose

XUE Bing1,LIANG Lin-lang1,SONG Wei1,SUN Lian-qing2*

(1.Department of Endocrinology,General Hospital of Shenyang Military Command，Shenyang 110016，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 710061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of ginsenoside Rb1 on the apoptosis in Schwann cells induced by intermittent high glucose (IHG).MethodsSchwann cells were obtained and primarily cultured from the sciatic nerves of neonatal Sprague-Dawley rats.The cultured cells were treated for 48 h with 5.6 mmol/L glucose as control (Con group),or with 5.6 mmol/L and 50 mmol/L glucose alternating every 8 h to mimic IHG (IHG group),or with IHG plus 100 μmol/L ginsenoside Rb1 (IHG+Rb1 group).Apoptosis was detected by flow cytometry.Level of 8-hydroxy-2-deoxy guanosine (8-OHdG) was detected by enzyme linked immunosorbent assay.The mRNA expression of Bax and Bcl-2 was detected by quantitative real-time reverse transcription PCR.The protien expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsAs compared with Con group,the percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG group were both increased (7.69 and 3.24 folds of control respectively，P<0.01).The mRNA and protein expression of Bax were up-regulated,while those of Bcl-2 were down-regulated in IHG group.Rb1 treatment inhibited the above effects induced by IHG.The percentage of apoptotic cells and the level of 8-OHdG in IHG+Rb1 group were decreased by 54.1% and 32.7 % respectively as compared with IHG group(P<0.05).The down-regulated mRNA and protein expression of Bax,and the up-regulated mRNA and protein expression of Bcl-2 were antagonized in IHG+Rb1 group as compared with IHG group.ConclusionGinsenoside Rb1 inhibits IHG-induced apoptosis in Schwann cells with certain neuroprotective effect

Key words：Ginsenoside Rb1;Schwann cell;Apoptosis

收稿日期：2016-02-10

基金項目：陜西省中醫藥管理局項目(13-LC088);陜西省自然科學基金(2014JM4118)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606003