UPLC-MS/MS法考察多西他賽納米脂質載體的大鼠體內藥代動力學研究

趙明明，路寶庭，李國飛，肇麗梅*

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UPLC-MS/MS法考察多西他賽納米脂質載體的大鼠體內藥代動力學研究

趙明明1，路寶庭2，李國飛1，肇麗梅1*

1.中國醫科大學附屬盛京醫院藥學部，沈陽 110004；2.天津康鴻醫藥科技發展有限公司，天津 300193

[摘要]目的以多西他賽注射液為參比制劑，研究多西他賽納米脂質載體在大鼠體內的藥代動力學。方法采用平行對照試驗法，12只大鼠隨機分成2組，每組6只，分別靜脈注射多西他賽納米脂質載體和多西他賽注射液10 mg/kg，建立UPLC-MS/MS法測定血漿中不同時間多西他賽的濃度，并計算藥代動力學參數。結果大鼠靜脈注射多西他賽納米脂質載體和多西他賽注射液后，t1/2分別為(3.12±0.66)、(2.22±0.51) h，Cmax為(21 731.57±2 751.01)、(7 062.30±681.62) ng/mL，Vss為(4.92±1.75)、(9.34±2.36) L/kg，CL為(1.07±0.20)、(2.91±0.39) L/(h·kg)，AUC0-t為(9 591.32±1 855.55)、(3 448.45±495.88) ng·h/mL，AUC0-∞為(9 647.89±1 845.93)、(3 488.34±492.14) ng·h/mL，各項藥動學參數比較差異均有統計學意義。結論本方法簡單快速，準確可靠，與多西他賽注射液比較，多西他賽納米脂質載體具有一定的緩釋和長循環特征。

[關鍵詞]多西他賽；納米脂質載體；藥代動力學；UPLC-MS/MS

0引言

多西他賽(Docetaxel，DTX)是從歐洲漿果紫杉(Taxusbaccata，European yew)中提取并經半合成所得到的產物。多西他賽屬于微管解聚抑制劑，通過干擾細胞有絲分裂和分裂間期細胞所必需的微管網絡而發揮抗腫瘤作用[1]。1995年4月，多西他賽在墨西哥首次上市，作為進展性乳腺癌和非小細胞肺癌的二線治療藥物；1996年5月獲得FDA批準，商品名為泰索帝(Taxotere)，用于先期化療失敗的晚期或轉移性乳腺癌、以順鉑為主的化療失敗的晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療[2]。目前，該藥物批準的適應證包括經蒽環類抗腫瘤藥物治療無效或仍復發的晚期和轉移性乳腺癌及曾經治療無效的非小細胞肺癌。由于多西他賽幾乎不溶于水，所以目前國內外上市的制劑是一種非水溶劑體系，即以Tween-80作為增溶劑，將藥物溶解于其中制備成的粘稠狀濃縮液。這種增溶劑和多種毒性反應有關，且該制劑臨床配制及使用過程非常不便，存在析出結晶和二次污染的風險。因此，利用新型藥物載體制備多西他賽新劑型，對提高其臨床療效與安全性有重大意義。

納米脂質載體(Nanostructured lipid carriers，NLC)是在固體脂質納米粒的基礎上，通過使用空間不相容混合脂質或添加特殊的脂質材料，或添加少量油類固體脂質，在一定條件下制備得到的納米給藥載體。這種體系在一定程度上降低了結晶度，擾亂了固體脂質規則的晶格結構，從而提高了藥物的載藥量，且減少了突釋效應[3]。本研究建立了UPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中多西他賽的方法，并以多西他賽注射液為參比制劑，對自制多西他賽納米脂質載體(DTX-NLC)在大鼠體內的藥代動力學行為進行研究。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters ACQUITYTMTQD UPLC/MS/MS三重四極桿液相色譜-串聯質譜儀(Waters Corp.，Milford，MA，USA)；ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；PF-101T 集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；TARGIN VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)；TurboVap?LV全自動樣品濃縮儀(美國Biotage公司)；TDL-40C低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；NicompTM380 動態光散射粒度測定儀(Santa Barbara，USA PSS)；Eppendorf 5424R高速冷凍離心機(Eppendorf 中國有限公司)。

1.2試藥多西他賽原料藥(上海三維藥業有限公司)；Pluronic F68(德國BASF公司)；注射用豆磷脂(德國Lipoid公司)；注射用甘油(浙江遂昌甘油廠)；脫氧膽酸鈉(北京奧博星生物技術有限責任公司)；單硬脂酸甘油酯(天津市博迪化工有限公司)；注射用油酸(德國Lipoid公司)；硬脂酸(天津市博迪化工有限公司)。多西他賽注射液(20 mg/瓶，艾素，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；紫杉醇(上海三維制藥有限公司)；肝素鈉(天津市生物化學制藥廠)；高純氮氣(沈陽市金屬研究所提供)；甲酸(DIMA Technology INC)；純化水(Barnstead EASYpure?II RF/UV 超純水系統純化)；叔丁基甲醚(國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇和乙腈等均為色譜純。

1.3動物Wistar大鼠，雌雄各半，體重(200±20) g，由沈陽藥科大學試驗動物中心提供。

2方法與結果

2.1DTX-NLC的制備稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸、豆磷脂和多西他賽加入適量的無水乙醇，70 ℃水浴條件下溶解，減壓蒸發，除去乙醇，得到透明均一的油相。將處方量脫氧膽酸鈉、F-68及甘油加到適量注射用水中，70 ℃水浴加熱攪拌至溶解，作為水相。然后趁熱將水相加入到相同溫度的油相中，繼續攪拌3 min，超聲分散10 min，攪拌條件下冰水浴中冷卻，即得DTX-NLC。

2.2DTX-NLC大鼠體內藥代動力學研究

2.2.1色譜條件ACQUITYTMUPLC 系統(Waters Corp.，Milford，MA，USA)；ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)與0.1%甲酸水(B)梯度洗脫，洗脫條件見表1；流速為0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

表1　超高效液相色譜梯度條件

注：*線性關系

2.2.2質譜條件Waters三重四級桿串聯質譜儀(Waters Corp.，Manchester，UK)；電噴霧離子化源；正離子電離方式；源溫：100 ℃；去溶劑化溫度：400 ℃；去溶劑氣流速：500 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；碰撞氣流速：0.2 mL/min；毛細管電壓：2.50 kV；二級錐孔電壓：3.0 V；掃描方式為多重反應監測模式(MRM)；用于定量分析的多西他賽離子反應條件為多西他賽m/z808.25→527.17，錐孔電壓為20 V，碰撞能量為10 eV；內標紫杉醇的離子反應條件為854.54→285.96，錐孔電壓為32 V，碰撞能量為20 eV。相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

圖1　多西他賽(A)和紫杉醇(B)[M+H]+的產物離子全掃描質譜圖

2.2.3溶液的配制對照品溶液的配制：精密稱取多西他賽25.3 mg,置于100 mL量瓶中，用甲醇溶液配制成250 μg/mL的儲備液。取適量儲備液，用甲醇溶液稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、2、5、10、20、50、250 μg/mL的DTX標準系列溶液，4 ℃冷藏保存備用。此外，精密稱取6.310 mg紫杉醇，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為631.0 μg/mL的內標儲備液，取儲備液適量，用甲醇稀釋成6.3 μg/mL，作為內標溶液使用。

2.2.4血漿樣品處理方法精密吸取血漿樣品100 μL于10 mL離心管中，加入內標溶液(6.3 μg/mL紫杉醇溶液) 20 μL，渦旋1 min混合均勻，然后加入提取溶劑叔丁基甲醚3 mL，渦旋混合10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，40 ℃條件下真空蒸發除去溶劑，進樣前用1 mL甲醇溶液復溶，渦旋10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。

2.2.5方法學考察①專屬性考察：分別取6只不同大鼠的空白血漿及給藥后血漿樣品各100 μL，按“2.2.4”項下方法操作處理，獲得空白血漿樣品和給藥后血漿樣品MRM 色譜圖，如圖2所示。在本研究的實驗條件下，多西他賽和內標的保留時間分別為1.49、1.50 min，兩者峰形良好，血漿中內源性雜質不干擾測定。

②標準曲線制備與定量下限：精密吸取100 μL大鼠空白血漿，分別加入多西他賽標準系列溶液20 μL，配制成相當于血漿濃度為0.01、0.02、0.04、0.10、0.40、1.00、2.00、4.00、10.0、50.0 μg/mL的血漿樣品，按“2.2.4”項下方法操作處理，進樣分析，記錄色譜圖，以多西他賽濃度C (ng/mL)為橫坐標、多西他賽與內標峰面積比值為縱坐標，采用加權(W=1/x2)最小二乘法(least squares)進行回歸計算，求得直線回歸方程即為標準曲線，所得回歸方程為：As/Ai=0.618 1 C +0.861 5 (r=0.993 7)?？梢姶笫笱獫{中多西他賽在10～50 000 ng/mL范圍內，Y與C線性關系良好，定量下限可達到10 ng/mL。

③精密度與回收率：制備多西他賽低、中、高濃度(20、1 000、40 000 ng/mL)的質量控制樣品(QC)，每一濃度取6個樣本進行分析，連續測定3 d，根據當日的標準曲線，計算QC 樣品濃度，根據QC 樣品測定結果計算方法的準確度和精密度，見表2。同時，另取大鼠空白血漿100 μL，按“2.2.4”項下操作至“4 000 r/min離心10 min”，向提取后的上清液中加入相應濃度的QC樣品溶液和內標溶液各20 μL，40 ℃真空蒸發除去溶劑，用1 mL甲醇復溶，渦旋10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液5 μL進樣分析，記錄色譜圖，獲得相應峰面積(6次測定的平均值)，以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，結果如表2所示。

圖2　大鼠血漿中多西他賽和紫杉醇的典型MRM色譜圖

濃度(ng/mL)日內RSD(n=6,%)日間RSD(n=18,%)提取回收率(n=6,%)20.009.7011.6066.9±10.11000.008.969.4165.0±4.640000.006.478.0372.1±2.7

④基質效應：取大鼠空白血漿100 μL，除不加入內標溶液外，按“2.2.4”項下操作至“4 000 r/min離心10 min”，向提取后的上清液中加入20 μL相應濃度的QC樣品溶液和內標溶液，40 ℃真空蒸發除去溶劑，用1 mL甲醇復溶，渦旋10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣測定，得到多西他賽的峰面積(6 次測定的平均值)，同時，另取超純水100 μL，代替血漿，同法操作，得到相應的峰面積，以含有基質樣品的峰面積與純水提取獲得的峰面積之比計算基質效應，低、中、高3個濃度的多西他賽的基質效應分別為100.44%±10.34%、102.45%±10.20%、104.68%±2.16%，紫杉醇基質效應為98.89%±4.03%。

⑤穩定性試驗：取DTX低、中、高3個濃度(20、1 000、40 000 ng/mL)的QC樣品，每濃度3個樣本，室溫條件下放置4 h后提取，提取后室溫放置4 h，考察-20 ℃凍融循環3次和-20 ℃冰凍放置1個月的穩定性，結果表明，多西他賽血漿樣品在上述條件下均有很好的穩定性(RE%<±15%)。

2.2.6藥代動力學試驗12只大鼠隨機分為對照組及受試組，采用平行對照試驗法，給藥劑量按照臨床推薦劑量換算為10 mg/kg。實驗前一晚禁食不禁水1夜，實驗日分別于尾靜脈單劑量注射市售DS和DTX-NLC注射液。于給藥前(0時)，給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h于眼眶取血0.3 mL，置于預先肝素化離心管中，4 000 r/min離心10 min，吸取上層血漿于-20 ℃保存待測。

2.2.7數據處理根據血藥濃度數據，采用DAS 3.0軟件計算數據，利用統計矩，計算藥代動力學參數，評價多西他賽兩種劑型的藥代動力學行為。藥動學分析的參數包括Cmax、Tmax、t1/2、清除率(CL)、穩態表觀分布容積(Vd)、AUC0-t和AUC0-∞。

利用統計軟件(SPSS 18.0)對兩種制劑的各項藥動學參數進行t檢驗。

2.2.8血藥濃度數據與藥代動力學參數12只大鼠靜脈注射10 mg/kg DTX-NLC和DS后，各時間點血藥濃度的平均值與時間的關系如圖3所示，主要藥代動力學參數見表3。由結果可以看出，DTX-NLC與DS比較，各項藥動學參數均有顯著差異，具體表現為DTX-NLC可顯著提高DTX的血漿藥物濃度和藥時曲線下面積，其中Cmax提高至3.11倍，AUC0-t提高至2.78倍。此外，大鼠靜脈注射DTX-NLC后半衰期延長，CL、Vd分別降低至0.37、0.53。因此，在相同給藥劑量下，DTX-NLC系統能夠使藥物在較長時間維持較高的血藥濃度，一定程度上延長體內循環時間，有利于產生更好的臨床抗腫瘤效果。

圖3　大鼠靜脈注射DS和DTX-NLC后多西他賽的

表3　大鼠靜脈注射多西他賽注射液和納米脂質載體后主要藥代動力學參數(n=12)

注：*與DS組比較，P<0.05

3討論

本研究建立了UPLC-MS/MS法對自制DTX-NLC在大鼠體內的藥代動力學行為進行研究，并與市售多西他賽注射液比較，該方法簡單快速，專屬性高，分析時間短，適用于大批量生物樣品的檢測，大大提高了分析效率。

本研究中自制的DTX-NLC屬于一種熱力學不穩定的均相分散體系，粒徑小[(100.3±48.61)nm]，包封率高(94.7%)，生物相容性好，毒性低。藥物高包封率的獲得可能是由于納米脂質載體中液態脂質的加入，增加了晶體的混亂度，從而可以容納更多的藥物分子[4]。

DTX-NLC的各項藥動學參數與DS相比均有顯著差異，Cmax和AUC0-t分別是DS的3.11、2.78倍，CL 和Vd分別是DS的0.37、0.53倍，提示DTX-NLC改變了DTX在大鼠體內的藥代動力學行為，具有一定的緩釋和長循環特征，但這仍需要進一步的組織分布和抗腫瘤活性研究的驗證。

在臨床上，多西他賽的使用方式為靜脈輸注，與本研究中大鼠的給藥方式不同，這可能會在一定程度上影響藥物在體內的正常代謝過程，因此有必要進一步進行大動物如Beagle犬或猿的藥代動力學研究。

參考文獻：

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[2]趙穎,王芮.抗腫瘤藥物多西他賽研究進展[J].中國藥業,2014,23(10):87-89.

[3]Iqbal MA,Md S,Sahni JK,et al.Nanostructured lipid carriers system:Recent advances in drug delivery[J].J Drug Target,2012,20(10):813-830.

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Stndy on pharmacokinetics of docetaxel nanostructured lipid carriers in rats by UPLC-MS/MS

ZHAO Ming-ming1,LU Bao-ting2,LI Guo-fei1,ZHAO Li-mei1*

(1.Department of Pharmacy,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.Tianjin Kanghong Pharmaceutical Technology Development Co.,Ltd.,Tianjing 300193,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the pharmacokinetics of docetaxel nanostructured lipid carriers in rats by taking docetaxel solution (DS) as the reference.MethodsTwelve rats were divided into 2 groups with 6 rats in each group.The DTX-NLC and DS were administrated to rats at single dose of 10 mg/kg,and the plasma concentration of docetaxel was determined by UPLC-MS/MS;the pharmacokinetic parameters were calculated.ResultsThe main pharmacokinetic parameters were as follows:the t1/2of DTX-NLC and DS were (3.12±0.66) and (2.22±0.51) h with Cmaxof (21 731.57±2 751.01) and (7 062.30±681.62) ng/mL,Vssof (4.92±1.75) and (9.34±2.36) L/kg,CL of (1.07±0.20) and (2.91±0.39) L/(h·kg),AUC0-tof (9 591.32±1 855.55) and (3 448.45±495.88) ng·h/mL and AUC0-∞of (9 647.89±1 845.93) and (3 488.34±492.14) ng·h/mL,respectively,and there were significant differences in the parameters between the rats before and after being administrated with DTX-NLC and DS.ConclusionThe UPLC-MS/MS method is simple,fast,accurate and sensitive.Compared with DS,DTX-NLC shows much higher concentration on plasma and sustained-release characteristics.

Key words：Docetaxel;Nanostructured lipid carriers;Pharmacokinetics;UPLC-MS/MS

收稿日期：2015-09-08

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606026