食品菌落總數測定影響因素分析

于東樹 陳金金 熊焱

摘 要：菌落總數是判定食品新鮮程度和微生物污染程度的質量安全指標，用于食品質量分析及衛(wèi)生學評價。對菌落總數測定實施有效控制，以保證測定結果的準確性，避免誤判。

關鍵詞：菌落總數測定；影響因素；分析

菌落總數是反映食品衛(wèi)生狀況的質量安全指標，用于判定食品的新鮮程度及微生物污染程度，結合大腸菌群及病原菌的檢測，對食品進行衛(wèi)生學評價。菌落總數測定在某種程度上具有相對的不可比性，必須對測定過程實施有效控制，以保證檢測結果的科學、公正、準確。

一、菌落總數測定概述

（一）菌落與菌落總數

1）菌落：細菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它是由數以萬計相同的微生物集合而成。當樣品被稀釋到一定程度，與培養(yǎng)基混合，在一定培養(yǎng)條件下，每個能夠生長繁殖的細菌細胞都可以在平板上形成一個可見的菌落。

2）菌落總數：食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（ml）檢樣中形成的微生物菌落總數。由于一個菌落并不一定是一個細菌所生成，因此菌落計數以菌落形成單位（CFU）表示為CFU/g（ml）。

（二）菌落總數測定方法

食品中菌落總數測定一般采用平板計數（CFU）法。即樣品25g（ml）+225ml稀釋液，均質后進行l(wèi)O倍遞增稀釋；選擇2～3個適宜稀釋度，各取1ml接種于無菌培養(yǎng)皿內，每個稀釋度接種二個平板；加入平板計數瓊脂培養(yǎng)基，混勻后培養(yǎng)；計算每個瓊脂平板上所生成的細菌菌落數，根據稀釋倍數計算出每g（m1）樣品中所含細菌菌落的總數CFU/g（ml）。

二、菌落總數測定中容易出現的問題

細菌的生長繁殖受多種因素影響，故菌落總數測定在某種程度上具有相對的不可比性。以下問題均會影響測定結果的準確性，甚至造成測定結果錯誤，嚴重時可導致誤判。

1）檢測人員：檢測技術不熟練或誤操作可影響檢測結果的準確性或誤判。2）檢測設備：檢測設備未進行量值溯源，或未對校準結果確認、未實施期間核查，及未對檢測設備進行維護、清潔，影響檢測結果的準確性或誤判。3）培養(yǎng)基和試劑：未進行培養(yǎng)基、試劑及標準菌株的采購驗證，不能有效保證其質量，或未按標準正確制備培養(yǎng)基和試劑，影響檢測結果的準確性或誤判。4）檢測設施和環(huán)境：微生物實驗室達不到標準規(guī)定的潔凈度等級，或未及時進行消毒滅菌和潔凈度檢測，造成檢測過程污染，導致檢測結果不準確甚至誤判。5）檢測過程：未嚴格進行無菌操作，采樣不具代表性及樣品污染，樣品稀釋誤差或接種、培養(yǎng)、計數等過程的操作不當均可導致檢測不準確或誤判。

三、菌落總數測定中的質量控制

食品微生物檢測是指按照一定的檢測程序和質量控制措施，確定單位樣品中某種或某類微生物的數量或存在狀況。為保證檢測結果的準確性，重點應做好以下環(huán)節(jié)的質量控制：

1）檢測人員：應掌握一定的微生物學知識，經設備操作、檢測技能、生物安全等專業(yè)知識培訓。可用已知樣品檢測及能力驗證等方式定期對檢測人員的能力進行考核評估。

2）設施和環(huán)境：微生物實驗室應符合“無回路”原則；應有安全警示標識及特殊狀態(tài)（如“污染”、“消毒”、“檢修”等）的臨時標識。應定期對設施和環(huán)境進行消毒滅菌，并無菌室空氣滅菌效果驗證方法（沉降法）對滅菌效果進行檢查驗證和確認。

3）檢測設備：檢測設備的配備與放置應滿足檢測要求，定期進行檢定/校準，適時進行期間核查、消毒滅菌，并按消毒與滅菌效果的評價方法對消毒滅菌效果進行評價。

4）培養(yǎng)基和試劑：應通過性能測試對培養(yǎng)基和試劑的采購及制備進行驗證和質量控制；培養(yǎng)基和試劑的配制應符合培養(yǎng)基制備質量保證要求。

5）檢測樣品：樣品應有代表性并按無菌操作采樣；采樣器具、容器應經消毒滅菌；送樣過程應避免污染。實驗室應盡快對樣品實施檢驗，若不能及時檢驗，應采取必要的措施以保持樣品的原有狀態(tài)，以免微生物變化。

6） 檢測過程：檢測過程的質量控制應特別注重以下環(huán)節(jié)：

a.檢測器具、培養(yǎng)基及稀釋液：檢測器具必須洗滌干凈后完全滅菌，不得殘留有抑菌物質；培養(yǎng)基和稀釋液應高壓滅菌。可通過空白對照以判定器具、培養(yǎng)基或稀釋液是否污染。

b.樣品制備：制樣器具應消毒滅菌，預包裝食品應對外包裝消毒，避免樣品污染。冰凍樣品解凍時間不宜過長，避免細菌增殖；稀釋液應充分振搖均勻；吸取不同稀釋度樣品應更換吸管，并避免吸管尖端伸入稀釋液內或吸管外部粘附檢液對檢測準確性的影響。

c.接種：根據食品衛(wèi)生標準或樣品污染情況選擇適宜的稀釋度，稀釋度過大菌落生長稀少，稀釋度過小菌落生長密度高，難以計數。傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內保溫，溫度過高影響細菌生長，過低瓊脂易凝固而不能與菌液充分混勻；培養(yǎng)基的量以15ml為宜，平板過厚影響觀察，太薄易于干裂。接種后應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻，使菌落均勻分布，避免菌落蔓延生長。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌死亡或繁殖及產生片狀菌落。為避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質對檢測結果的干擾，可同時作一稀釋液與瓊脂培養(yǎng)基混合的平板，于4℃環(huán)境中放置，以便計數時對照觀察。

可采用“夾心法”即在樣液上下各傾注一層瓊脂防止瓊脂和平皿之間形成水膜樣的蔓延菌落。

d.培養(yǎng)：應適時對培養(yǎng)溫度進行檢查，防止溫度過高菌落蔓延生長；應防止因通風和空氣循環(huán)而造成的培養(yǎng)基太干，而影響細菌正常生長。為保證細菌正常繁殖，培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應超過15%。

e.計數：到規(guī)定培養(yǎng)時間后應立即計數，如不能立即計數，應將平板放置于0～4℃保存，但不得超過24h。一般情況，同一稀釋度二個平板的菌落數應基本接近；不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比，即稀釋倍數愈高菌落數愈少，稀釋倍數愈低菌落數愈多，如出現逆反現象，則應視為檢驗差錯或可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數報告的依據。在計數時應采取多人同時進行，以避免視覺疲勞造成的誤差。

GB/T27405-2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品微生物檢測》對微生物檢測實驗室的管理、技術、過程控制、內部質量控制和外部質量評估有明確的規(guī)定，檢測過程必須實施有效的質量控制，以保證檢測結果準確性，避免誤判。