奧沙利鉑耐藥相關機制研究進展

石鳳靈　袁蘇徐　梁容瑞

[摘 要] 奧沙利鉑已廣泛用于臨床腫瘤化療，腫瘤細胞內固有性或獲得性耐藥是奧沙利鉑治療失敗的主要原因。研究奧沙利鉑耐藥的分子機制對規避、改善這種現象以及優化治療方案非常重要。目前已發現的奧沙利鉑相關的腫瘤耐藥機制包括轉運、解毒、DNA損傷反應以及修復等，文章綜述銅轉運蛋白、膜轉運蛋白超家族、ABC轉運蛋白、谷胱甘肽系統以及奧沙利鉑誘導-DNA加合物的修復，進一步揭示腫瘤細胞對奧沙利鉑耐藥的分子過程，尋找針對性的逆轉耐藥策略。

[關鍵詞] 奧沙利鉑；耐藥；分子機制；DNA修復

中圖分類號：R730.53 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）03-001-04

DOI：10.11876/mimt201603001

奧沙利鉑（Oxaplatin，OXA）是第3代鉑類藥物，目前用于大腸癌、胃癌和胰腺癌治療，卵巢癌、乳腺癌和非小細胞肺癌等其他癌癥已進入臨床試驗。OXA在2000年開始用于治療轉移性結直腸癌，它不僅提高了客觀緩解率和結直腸來源轉移腫瘤（主要是肝轉移）切除率，還延長了總生存期（OS），而順鉑和卡鉑等其他鉑類藥物已被證實治療轉移性結直腸癌無效。OXA聯合5-氟尿嘧啶（5-FU）治療方案相比5-FU單藥治療方案，客觀緩解率由15%增加至50%[1]。過去十余年，得益于此組合，大腸癌療效得到顯著改善，其中位生存期增加至24個月[1]，四分之一患者無病復發時間超過10年。轉移性結直腸癌患者經過OXA化療后成功切除轉移灶。然而，腫瘤固有性或獲得性耐藥仍可對抗OXA殺傷效果。因此，闡明OXA耐藥機制并尋找有效針對性逆轉耐藥策略具有積極意義。本文將闡述OXA耐藥性分子作用機制，包括其在細胞內運輸和解毒、DNA修復機制改變、表觀遺傳學改變以及細胞死亡機制。

1 OXA作用機制

奧沙利鉑（左旋反式二氨環己烷草酸鉑）是鉑類化療藥物家庭中一員。其中央鉑原子被一草酸和 1，2-二氨基環己烷包圍。這種結構差異使OXA與其他鉑類藥物相比具有不同活性，能夠激活不同細胞損傷識別機制[2]。它是一種靜脈滴注化療藥物，其藥學動力學特點是：初始階段藥物分布所需時間短，藥物排泄主要通過腎臟，一般給藥后48h達到完全清除，此藥主要劑量限制性毒性是末梢神經毒性。OXA進入細胞后可以與親核分子（主要是DNA，也有RNA和蛋白質）結合。作為一個DNA交聯劑，OXA可以將DNA作為靶點，鉑原子與DNA鏈上鳥嘌呤（G）共價結合，形成鏈內交鏈、鏈間交鏈，從而干擾DNA復制以及轉錄。與順鉑相比，OXA結構比較大，所以相同質量OXA分子數比順鉑更少，但是OXA卻可表現出更高細胞毒性，這可能與其特有化學結構相關。1，2-二氨基環己烷-鉑配合物存在3種同分異構體，這3種同分異構體與DNA相互作用方式不同。核苷酸切除修復（NER）是OXA誘導DNA損傷修復主要途徑。

2 OXA出胞入胞及其解毒作用

通常認為鉑類藥物是通過被動轉運進入細胞，但在過去幾年中越來越多證據表明協同轉運或主動運輸在OXA轉運過程中起著重要作用[3]。與OXA耐藥相關最重要的細胞轉運和解毒系統如下。

2.1 銅轉運蛋白

研究證實銅出胞和入胞轉運蛋白在鉑類藥物累積過程中起重要作用[4]。雖然人類銅轉運蛋白1（hCTR1）參與細胞對OXA吸收過程，但其抗吸收耐藥作用機理尚不清楚。實驗報道，hCTR1負轉錄調控因子可導致順鉑和卡鉑耐藥，但卻對OXA敏感性無顯著影響。這表明可能其他轉運方式參與了細胞對OXA攝取過程，同時也提示OXA擁有不同活性位點。兩種細胞內P型ATP酶（ATP7A and ATP7B）參與隔離和排出銅，這兩種酶也被證實在鉑類耐藥中起著重要作用。Howells團隊報道ATP7A和B能夠隔離細胞內順鉑、卡鉑和OXA，使其無法與細胞內DNA或蛋白等靶點相結合，從而限制其細胞毒性[5]。但ATP7A酶與鉑類藥物結合后卻不能進一步將藥物通過細胞膜轉運至胞外，這一點與銅轉運出細胞過程有明顯區別。此外，缺乏銅轉運蛋白細胞能抵抗順鉑和卡鉑毒性作用，但缺乏轉運蛋白細胞對OXA敏感性反而更高。在缺乏銅轉運蛋白細胞中OXA暴露后細胞內鉑-DNA加合物水平明顯增加，但在順鉑或卡鉑暴露細胞中卻沒有出現同樣現象。近日，同一組文獻報道：Sec61β和Sec61蛋白易位通過ATP7A酶負轉錄調控及其分布影響鉑類藥物毒性，但不影響其他銅轉運蛋白如hCTR1，hCTR2，ATP7B或抗氧化劑銅分子伴侶[5]。根據我們的經驗，對OXA獲得性耐藥常常伴隨著對銅交互抵抗和對hCTR1表達負調控。當親本和OXA獲得性耐藥細胞株接觸到OXA時，只在敏感細胞周圍觀察到了ATP7A酶顯著上調。雖然在臨床前或體外水平方面存在廣泛參考文獻，但是OXA治療病人中，銅轉運蛋白臨床影響數據卻非常有限。我們研究了使用OXA一線化療方案大腸癌腫瘤患者ATP7A酶和ATP7B酶的表達水平，發現低水平ATP7B酶化療效果更好。由于缺乏更大量臨床實驗研究，檢測銅轉運蛋白水平很難成為OXA耐藥性標記檢測標準。

2.2 膜轉運蛋白載體超家族

溶質載體（the solute carrier， SLC）轉運蛋白在腸、肝、腎生理吸收和/或排泄藥物中發揮作用。人類SLC22參與不同物質解毒作用。其中，有機陽離子轉運蛋白（organic cation tranporters， OCT）家族參與鉑類藥物運輸，它包括SLC22A1（OCT1），SLC22A2（OCT2）和SLC22A3（OCT3）3類，OCT2表達水平對順鉑和OXA吸收和細胞毒性呈明顯正相關。穩定表達hSLC22A2基因（OCT2）、人類胚胎（HEK）293細胞對OXA比較敏感，在較小程度上對順鉑也敏感[6]。然而，人類卵巢癌研究中僅15%病例發現這種轉運蛋白陽性表達，并沒有統計學意義。值得注意的是在人類9種大腸癌細胞株中并未檢測到OCT2mRNA表達[6]。因此，雖然在卵巢癌細胞體外實驗中，這種轉運蛋白似乎能夠將OXA轉運至細胞中，但是其在卵巢癌中低表達表明臨床標本與細胞實驗相關性有限。文獻報道其在人類大腸癌中陽性率50% [7]，表明仍需進一步臨床研究驗證其作為腫瘤相關有效性預測指標價值。

2.3 ABC轉運蛋白

目前，超過80%化療藥物主要通過藥物外排轉運體ABC家族排出到腫瘤細胞外。ABCC亞科包括多藥耐藥相關蛋白（MRP）參與鉑類藥物耐藥。卵巢癌體外模型證實MRP1和MRP4參與OXA耐藥，這些轉運蛋白表達增加和N-連接糖基化改變，增強了對OXA耐藥性[8]。OXA耐藥性與ABCB1（MDR1）表達之間關系研究結果沒有顯示出令人信服結果。雖然Ekblad等在體外實驗中模擬了過表達MDR1使細胞產生對OXA獲得性耐藥，但是與親本系對照組相比，在OXA耐藥細胞中ABCB1轉運蛋白功能并沒有明顯增加[9]。Lee等報道，人結直腸癌細胞株和臨床樣本中這些轉運蛋白和OXA敏感性之間沒有相關性[10]。除了ABC轉運蛋白外，在體外和Na/K-ATP酶獨立活性條件下，已發現Na/K-ATP酶（β1）亞基低表達和OXA耐性藥相關。細胞主要通過Na/K-ATP酶排取Na，Na不僅使細胞內保持離子穩態，而且對維持上皮細胞極化狀態至關重要。

3 谷胱甘肽系統

腫瘤細胞對鉑類藥物耐藥一個重要機制是谷胱甘肽（GSH）介導藥物外排使細胞內鉑類藥物含量下降，谷胱甘肽由ABCC載體蛋白質家族調節。OXA一旦到達細胞質就變成水合物，有利于其與含有金屬硫蛋白等含巰基分子如谷胱甘肽等進行反應。體外實驗研究谷胱甘肽表達水平及活性與OXA耐藥相關性時得出了相互矛盾結果：Arnoud S認為谷胱甘肽活性和鉑細胞毒性不相關[11]；而張等認為高表達谷胱甘肽降低了奧沙利鉑細胞毒性，他們在研究慢性淋巴細胞白血病（CLL）時發現，CLL細胞內GSH含量與OXA耐藥呈正相關，而CLL合成GSH主要原料半胱氨酸則來源于骨髓基質細胞釋放到腫瘤微環境中，并被CLL細胞攝取利用[12]。

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）催化GSH與有毒性和致癌性親電基團結合從而保護細胞中大分子免受損傷。GST超家族不同亞型（α，μ，π，θ，Zeta）中，GSTPi直接參與順鉑解毒，GSTπ亞型在結腸癌和耐藥腫瘤中高表達，GSTπ水平是人體對順鉑固有和獲得性耐藥重要決定因素，但卻缺乏其參與OXA解毒作用證據。Tozawa等證明在OXA治療非小細胞肺癌移植瘤模型（NSCLC）中GSTπ水平增加，GSTPi升高與順鉑耐藥性有關，對順鉑耐藥胃癌細胞株卻對OXA敏感[13]。但Arnould和Pendyala研究結果卻提示GST活性和OXA細胞毒性之間缺乏相關性[11，14]。盡管有爭議，許多雜志還是報道了GSTπ基因變異和OXA化療之間影響。具體來說，已證實該基因多態性會影響該蛋白與不同細胞毒藥物結合能力進而影響酶活性，隨之影響腫瘤細胞化療作用。因此，OXA為基礎化療方案用于術后輔助化療、轉移結直腸癌和胃癌，該Val/Val基因型（降低酶活性）與獲得更好OS相關[15]，雖然也有相反結果文章發表[16-17]，但目前大多數研究人員仍然認為GSTπ可能導致OXA耐藥。相反結果可能與研究設計差異有關，如有研究在一線化療方案中使用OXA[16]，有研究在二線方案中使用OXA[17]；其他因素如樣本大小等可能也是導致結果差異原因，因此需大樣本、多中心、前瞻性臨床試驗來驗證這些數據。

4 OXA-DNA加合物修復

DNA加合物形成是鉑類化合物發揮抗癌活性必不可少的部分。因此，加合物識別和/或修復分子機制在決定它們抗癌活性方面起著重要作用。錯配修復系統（MMR）可以完成順鉑-DNA加合物識別及修復，但對OXA-DNA加合物并不起作用。正是由于這個原因，有MMR缺陷腫瘤對順鉑固有耐藥，卻對OXA敏感。結直腸癌患者常存在MMR系統功能缺失，但OXA針對此類病例仍然有效，順鉑或卡鉑則無效[18]。

NER系統在體外試驗中被證明能夠修復順鉑和OXA所誘導DNA損傷。NER一個最重要介質：切除修復交叉互補組1（ERCC1）和它的催化伴侶XPF（xeroderma pygmentosum group F，ERCC4）參與OXA耐藥。體外模型實驗證實，內源性ERCC1低水平表達或者敲除沉默都使細胞對OXA更為敏感[19]。近期文獻報道，在用OXA治療后ERCC1反應性表達上調依賴于KRAS調控，KRAS突變細胞不能上調ERCC1表達導致對藥物敏感性增加[20]。NER系統中其他蛋白質如XPF，XPG（xeroderma pygmentosum groupG，ERCC5）亦與OXA耐藥性相關。因此，在OXA處理細胞中，用siRNA介導這些基因沉默降低了DNA修復效率，使得其對OXA更敏感[21]。也有報道與此結論相悖：stordaland等認為ERCC1表達下降與OXA誘導細胞周期阻滯相關，而與耐藥或改變DNA修復能力無關[22]。在OXA獲得性耐藥體外模型中，發現部分細胞能夠上調XPD（xeroderma pygmentosum group D，ERCC2）和ERCC1基因表達，而相同遺傳背景OXA耐藥細胞株卻未出現上述基因表達上調。一些臨床研究報道ERCC1基因腫瘤表達水平和OXA治療效果之間具有相關性[23]。在ERCC1陽性Ⅲ期結直腸癌患者中使用OXA，其5年DFS和OS更短[24]。雖然臨床和臨床前數據顯示ERCC1表達與OXA治療存在相關性，但仍需要大樣本和前瞻性研究證實ERCC1基因表達水平與OXA治療相關性。

研究證實，包括OXA在內鉑類化療藥物能夠誘導自由基產生，導致氧化性DNA損傷。堿基切除修復系統（BER）是DNA修復主要途徑，它負責清除錯配DNA堿基以及修復單鏈斷裂DNA，改變BER活性將會影響鉑類藥物化療效果。因此，Preston等證實OGG1（羥基鳥嘌呤糖苷酶1）異常表達或與其功能相同的同源基因大腸桿菌甲酰胺基嘧啶糖苷酶（FPG）異常表達，可激活氧（ROS）引發劑來降低鉑類藥物導致細胞死亡[25]。

另一個假定OXA耐藥機制是通過DNA聚合酶β，γ，η誘導OXA-DNA加合物。例如，在結腸癌和胃癌細胞株中，BER DNA聚合酶中Polβ或Polγ過表達和OXA耐藥性呈正相關[26]。在使用包括OXA在內不同鉑類藥物后，觀察到REV1和Polζ能夠促進跨損傷DNA合成及DNA損傷修復[27]。

已有研究涉及常見DNA修復相關基因變異與OXA耐藥關系，其中，ERCC1基因118密碼子沉默突變已被廣泛研究，一項回顧性臨床研究結果顯示OXA對T/T基因型有效，也有文獻報道T等位基因與OXA效果負相關或者缺少關聯性[28]。據報道，在亞洲非白種人中，T等位基因降低與較差無進展生存期（PFS）和OS相關[29]。Gao等對這些差異進行解釋，他們認為，C118T本身和表型差異沒有聯系，這種多態性可能與其他致病變異或單倍型有關。例如，NSCLC根治切除患者使用鉑類化療方案，ERCC1基因30非編碼區（UTR）中（C8092A）SNP可以預測OS。此外，在歐洲人群中，該C118T SNP與ERCC1內一個18kb單倍體缺失及其相鄰基因組區域相關。因此，第一點是弄清楚單核苷酸多態性是否存在連鎖不平衡，第二點是位置8092基因C突變成A后對該基因功能有何影響以及在DNA修復基因中一些其他基因突變與OXA療效相關性。現已證明在X線修復交叉互補蛋白1（XRCC1）中，一些導致氨基酸改變SNP（Arg-Gln）往往預示著腫瘤預后較差[30]。在以鉑類為基礎的腸癌和胃癌化療中，XPDK751G多態性與預后相關，與Lys/Lys基因型相比，Gln/Gln基因型患者預后更差[31]。Kim do將患者隨機分組，接受FOLFOX聯合方案或者根據多態性基因治療方案，FOLFOX化療方案選擇基于基因型XPD-751、GSTP-1-105和XRCC1-399，與非選擇性患者相比，預選組有較高反應率[32]。Cubillo等根據拓撲異構酶I，ERCC1，胸苷酸合成酶，和胸苷磷酸化酶表達情況為74位患者選擇不同化療方案（包括OXA），結果表明，和已報道標準結果相比，這些患者并沒有表現出更好預后[33]，但這項研究缺乏對照組，因此，研究者仍需要進行更大量和確鑿試驗。

參 考 文 獻

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