蝦-貝-紅樹林耦合循環水養殖系統中微生物群落分析

張 翔閆茂倉肖國強柴雪良謝起浪（1.浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，溫州 325005）

蝦-貝-紅樹林耦合循環水養殖系統中微生物群落分析

張 翔1，2閆茂倉1，2肖國強1，2柴雪良1，2謝起浪1，2
（1.浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，溫州 325005）

摘要：海水循環水養殖系統是重要的生態養殖模式發展趨勢之一，為了深入了解循環水養殖生態系統，通過對系統各功能區水體中細菌16S rDNA基因V4—V5區進行高通量測序和生物信息學分析，從微生物生態學角度分析了循環水養殖系統不同功能區的細菌群落結構動態。測序分析結果顯示，海水循環水養殖系統中優勢細菌種群分別屬于變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）。紅樹林濕地水體中變形菌門和厚壁菌門豐度較高，而對蝦養殖池的擬桿菌門和浮霉菌門豐度較高。在不同優勢類群中，變形菌門多樣性指數平均值最高，其次是擬桿菌門，厚壁菌門最低。在各功能區中，紅樹林細菌多樣性最高，蝦池最低。MDS分析結果顯示蝦池、貝池和紅樹林濕地水體中細菌群落結構有明顯差異，蝦池與其他功能區差異最大。研究表明，高密度對蝦養殖對蝦池水體中細菌群落有顯著影響，但其影響在循環水養殖系統后續功能區中逐漸減弱。

關鍵詞：浮游細菌； 循環水系統； 紅樹林人工濕地； 高通量測序； 16S rDNA

海水對蝦養殖通常是在臨近海岸線的池塘中進行，以方便換水，保持池塘水質清新，然而，進入池塘的海水也會含有病毒和細菌性病原體，這將給海水養殖帶來潛在風險。此外，養殖尾水的直接排放將破壞周邊水體生態環境，同時導致近海海域水體富營養化程度進一步加深，所以海水養殖池塘的尾水排放一直是海水養殖業與海洋環境和諧發展的關鍵問題［1，2］。循環水養殖系統（Recirculating Aquaculture System，RAS）提供了解決以上兩個問題的方法，能通過最大化減少水需求，從而將病原輸入和污染輸出最小化［3］。海水循環水養殖系統是利用生態學原理，將若干個功能區，例如人工濕地、排水溝、養殖池塘、生態凈化池等有機地結合在一起，從而構建成尾水零排放的新型生態安全養殖系統。

在循環水養殖系統中，為了養殖對象的健康生長，除了日常監測和管理溶解氧和氮磷水平外，對于定植于其中的微生物種群進行管理同樣十分重要。微生物作為海水循環水養殖系統的關鍵部分，在人工濕地和養殖池塘中執行著重要功能，包括有機碎屑的分解和礦化、氮磷等營養元素的轉化、直接作為餌料提供給養殖對象等等［4，5］。同時，病原性微生物的數量和種類又與水產動物的疾病發生率和死亡率相關，直接影響著海水養殖的收益。特別是異養細菌在溶解氧消耗、代謝副產物釋放方面有著重要影響，并最終與自養細菌競爭溶解氧和生存空間［6，7］。因此，雖然我們知道循環水系統中水質好壞依賴于微生物群落，但對于其中大部分微生物尚未有詳細研究［8］。先前的環境微生物多樣性研究多基于DNA指紋圖譜（例如DGGE）和16S rDNA基因克隆文庫技術［8，9］，但受技術本身所限，難以全面深入地解析細菌群落結構。隨著高通量測序技術的發展，基于16S rDNA基因片段的高通量測序逐漸成為微生物群落組成研究的主要手段，其最大的優勢在于能夠全面的解析微生物群落中的細菌種類和豐度。

本文以紅樹林人工濕地-海水養殖耦合系統為研究對象，通過對養殖水體中細菌16S rDNA V4—V5區的高通量測序，分析了該系統中微生物群落組成，揭示了不同功能區微生物群落的差異，為循環水養殖系統的運行管理及改良提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 采樣站點

浙江溫州某養殖基地構建了一套海水多生態位耦合設施化循環水養殖系統。該循環水養殖系統主要由高位精養池、循環水渠、貝類養殖池、紅樹林人工濕地、生態凈化池和砂濾池等組成，通過循環水渠、管道、水泵等設施實現養殖尾水的凈化和再利用。高位池為全封閉式，使用循環水養殖系統砂濾水作為進水，養殖對象為南美白對蝦，養殖期間全天進行底增氧曝氣。貝類養殖池養殖對象為文蛤和泥蚶，露天開放式養殖，除接收蝦池尾水外，不再進行肥水。紅樹林濕地種植秋茄，秋茄平均株高1.5 m左右。采樣站點設置于各個功能區，包括對蝦養殖池（S1）、貝類養殖池A（S2）和B（S3）、紅樹林濕地進水口（S4）和出水口（S5）、生態凈化池（S6）。采集各個功能區中上層水樣，每個水樣100 mL用2片無菌濾膜（Millipore，0.22 μm）進行抽濾，然后將濾膜封裝于自封袋中，凍存于-80℃超低溫冰箱，保存至DNA提取。

圖 1 循環水養殖系統排水流程示意圖

1.2 DNA提取和MiSeq高通量測序

將濾膜用滅菌手術剪剪碎，放入50 mL無菌離心管中，利用水體環境基因組提取試劑盒Water DNA kit（Omega）提取濾膜中環境基因組DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測。

PCR在ABI GeneAmp 9700 型熱循環儀中進行，引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），每個樣品3個重復。PCR反應采用TransGen 20 μL體系，其組分為:5×FastPfu buffer，4 μL； 2.5 mmol/L dNTPs，2 μL； 5 μmol/L 正反向引物各0.8 μL；FastPfu DNA聚合酶（10 U/μL），0.4 μL； 模板DNA 10 ng； 加滅菌ddH2O補足至20 μL。PCR反應參數如下:95℃預變性3min，然后95℃變性30s； 55℃退火30s； 72℃延伸30s，共計28個循環，最后72℃延伸10min。將同一樣品的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN）切膠回收PCR產物，TE洗脫液洗脫，2%瓊脂糖電泳進行檢測。PCR產物定量后利用Illumina Miseq PE250平臺進行高通量測序。

1.3 數據統計分析

根據Barcode序列將下機數據拆分為不同樣品數據，并截去Barcode序列和PCR擴增引物序列。使用FLASH Version 1.2.7對各樣品reads進行拼接并進行處理得到高質量Tags數據，并利用Qiime Version 1.7.0檢測并去除嵌合體序列。之后將Tags序列與數據庫（Gold database）進行比對（UCHIME algorithm）。利用Uparse Version 7.0.1001 對所有樣品重采樣的有效序列進行聚類，默認將具有97%一致性的序列聚類成為操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）。將Uparse構建OTU時選取的代表性序列與Silva 119庫比對，得到每個OTU的分類學信息，每個OTU在數據分析中被視為一種細菌。

使用R語言（R version 3.1.3）中的vegan程序包計算各個采樣站點間細菌群落OTU的布雷柯蒂斯（Bray-Curtis）距離矩陣，然后通過生物統計軟件XLSTAT 2014進行多維尺度分析（MultiDimensional Scaling，MDS）并作圖。選取各個站點中OTU數量所占比例超過總數1%的細菌，利用R語言（R version 3.1.3）作熱圖。細菌類群多樣性采用Shannon-Wiener 指數（H′）表示，H′可反映細菌種群物種多樣性的差異。

2 結果

2.1 高通量測序質量分析

對各樣品中Miseq高通量測序結果進行統計分析，結果表明所有樣品的測序覆蓋率全部達到99%以上，測序結果能較好地反映不同采樣站點浮游細菌的群落組成。海水循環水養殖系統不同功能區的有效OTU 數量平均值為425.17，其中蝦貝養殖池（S1—S3）的OTU數量低于平均值，而經過紅樹林人工濕地處理后的水樣（S4—S6）高于平均值（表 1）。

通過隨機抽取的序列數及其所含的OTU 數量構建高通量測序的稀釋曲線（圖 2），結果顯示，所有樣品的稀釋曲線均隨有效序列數量的增加而趨于平緩，這表明測序獲得的有效OTU數量較好地反映浮游細菌的物種多樣性。

表 1 各樣品高通量測序結果分析Tab.1 The analysis of the high-through sequencing results

圖 2 各樣點高通量測序結果的稀釋曲線

2.2 各功能區微生物群落組成分析

細菌分類學信息顯示，海水循環水養殖系統中的優勢細菌種群分別屬于變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和浮霉菌門（Planctomycetes）（圖3）。如表 2所示，不同采樣站點中6個優勢細菌類群共占細菌OTU總數的97%—99%，同時不同站點間細菌種群相對豐度變化明顯，結果顯示:對蝦養殖池（S1）擬桿菌和浮霉菌豐度明顯高于其他站點； 貝類養殖池（S2—S3）變形菌和厚壁菌平均豐度低于經紅樹林濕地處理后的各個站點（S4—S6），而藍藻豐度則較高。對測序結果進行相似性聚類（圖 3）和MDS分析（圖 4），結果顯示紅樹林進水（S4）、出水（S5）和生態凈化池（S6）較為相似，其次是兩個貝類養殖池（S2、S3），而對蝦養殖池（S1）與其他站點相似性較低。

選取所有樣品中占1%以上的優勢細菌種群構建熱圖。結果顯示，占細菌總數比例超過1%的O T U共4 4種，在各站點所占總比例分別為84%（S1）、77%（S2）、78%（S3）、67%（S4）、73%（S5）和80%（S6）（圖 5）。蝦池中豐度較高的OTU分別屬于芽孢桿菌屬、藍藻、黃桿菌目、腐螺旋菌科、浮霉菌、鞘脂桿菌目、紅細菌科； 紅樹林濕地與蝦池差異明顯，豐度較高的OTU分別屬于芽孢桿菌屬、聚球藻屬、酸微菌科、乳球菌屬、微桿菌科和變形菌SAR11演化枝。

2.3 各功能區細菌類群分析

計算了各個采樣站點優勢門類細菌的Shannon-Wiener多樣性指數（H'），結果顯示（圖 6）變形菌門多樣性指數平均值最高，其次是擬桿菌門，最低為厚壁菌門。同時，對蝦養殖池（S1）各個門類細菌多樣性均低于其他站點，厚壁菌門除外。而紅樹林進水處（S4）各個門類細菌多樣性均高于其他站點，放線菌除外。

通過MDS分析了各個優勢類群的采樣點間群落組成差異（圖 7），結果顯示不同優勢菌群的空間變化規律并不一致，其中除厚壁菌門，其他優勢細菌類群空間分布模式與總細菌類似，均顯示S1明顯與其他站點不同。而厚壁菌MDS分析僅將貝類養殖池（S2、S3）與其他站點區分開，S1與其他站點聚為一類。

圖 3 循環水養殖系統浮游細菌群落結構組成

表 2 優勢細菌類群在不同站點細菌OTU中所占比例Tab.2 OTU ratio of dominant bacterial subgroups in different stations（%）

圖 4 環水養殖系統浮游細菌群落多維尺度分析

3 討論

紅樹林人工濕地-蝦貝養殖耦合系統作為海水循環水養殖系統，通過循環水渠、管道、水泵等設施將對蝦高位池、貝類養殖池、紅樹林人工濕地和生態凈化池串聯成一個有機整體，利用紅樹林人工濕地去除水體中的氮磷和顆粒懸浮物，不但能有效地增加海水利用率，減少尾水排放，而且能明顯改善水質，提高水產品質量。為了揭示整個循環水養殖系統中浮游細菌動態，為系統管理提供依據，本文通過高通量測序技術研究了各個站點的細菌群落結構和空間差異。

南美白對蝦進行高密度養殖時，由于飼料供給充足導致對蝦產生排泄物的過程十分迅速，有研究表明其腸道通過時間會縮短30%—60%［10，11］，這意味著高密度養殖模式下養殖水體與對蝦腸道的微生物交換更加頻繁，水體中細菌群落對南美白對蝦健康影響也更大。在本研究中，對蝦養殖池中擬桿菌和浮霉菌在總細菌中所占比例明顯高于循環水養殖系統其他功能區，在蝦池排水進入貝類養殖池塘后，擬桿菌和浮霉菌所占比例已明顯下降。之前的研究報道海水中擬桿菌大量存在于水中懸浮顆粒物上，而自由生活的擬桿菌相對較少［12］，這可能暗示了擬桿菌在蝦池水體有機懸浮顆粒（蝦糞和殘餌）上豐度較大，而在后續功能區有機顆粒物減少，從而引起擬桿菌豐度降低。同時有研究發現浮霉菌參與反硝化作用［13］，在高污染的膜上豐度相對較大［14］，這表明蝦池水體中較高的污染物含量可能導致浮霉菌豐度進一步提高，而后續功能區中浮霉菌豐度隨污染物濃度降低。

Zhang等［15］研究了湖泊中不同細菌類群組成的空間動態，結果表明厚壁菌空間異質性與其他細菌類群明顯不同，不同站點間群落結構相似度高。在本研究中同樣發現由于厚壁菌群落多樣性較低（0.5

圖 6 采樣站點優勢細菌類群Shannon-Wiener多樣性指數

人工濕地技術建設成本、運行費用低，并且管理方便，在污水處理技術中環境和生態效益兼而有之。人工濕地是通過植物根系-基質-微生物的共同作用去除水體中的污染物［17，18］。由于海水養殖中海洋廢水的鹽度效應，在人工濕地技術中針對海水養殖廢水處理的可選擇植物較少，而紅樹植物是海水人工濕地技術中重要組成部分。紅樹植物對于海水環境中污染物去除起著重要作用，李飛等［19］研究表明，種植紅樹的池塘中牡蠣石油烴含量顯著低于未種植紅樹的對照塘（P < 0.05）。在本研究中，人工濕地采用鹽生紅樹植物秋茄作為濕地植物，建設了表面流人工濕地，與蝦貝養殖池塘（S1-S3）相比，紅樹林水體環境（S4、S5）微生物OTU數量明顯增加（表1），紅樹林出水所帶的細菌有可能增強了生態凈化池的凈化作用。Lexonard等［20］研究發現循環水養殖系統中生物濾膜表層細菌會脫離濾膜進入水中，導致過濾后水中細菌總數較過濾前提高25%。本研究同樣發現紅樹林濕地使得后續生態凈化池中細菌OTU數量高于蝦貝養殖池。孫靜等［21］研究發現紅樹林土壤中變形菌和厚壁菌是優勢菌群，分別占66%和19%。在本研究中紅樹林濕地水體中變形菌和厚壁菌所占比例高于貝類養殖池，這可能是由于紅樹林濕地土壤中的大量變形菌和厚壁菌在水流作用下，從土壤逸出進入水體所致。

圖 7 各采樣站點在細菌門水平的多維尺度分析

綜上所述，海水循環水養殖系統中優勢細菌種群分別屬于變形菌門、藍藻門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和浮霉菌門。在各個功能區水體中，紅樹林濕地變形菌和厚壁菌豐度較高，貝類養殖池藍藻豐度較高，而對蝦養殖池的擬桿菌和浮霉菌豐度較高。在不同優勢類群中，變形菌門多樣性指數平均值最高，其次是擬桿菌門，厚壁菌門最低。同時，對蝦養殖池細菌類群多樣性均低于其他站點，厚壁菌門除外。而紅樹林進水處各個門類細菌多樣性均高于其他站點，放線菌除外。MDS分析結果顯示對蝦池、貝池和紅樹林濕地細菌群落有明顯差異，其中對蝦池與其他功能區的差異最大。

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ANALYSIS OF MICROBIAL COMMUNITY STRUCTURE IN MANGROVE CONSTRUCTED WETLAND-MARICULTURE COUPLING SYSTEM

ZHANG Xiang1，2，YAN Mao-Cang1，2，XIAO Guo-Qiang1，2，CHAI Xue-Liang1，2and XIE Qi-Lang1，2
（1.Zhejiang Mariculture Research Institute，Wenzhou 325005，China； 2.Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bioresource，Wenzhou 325005，China）

Abstract:Bacteria play a key role in the biological geochemical cycle and degradation of organic contamination in pond ecosystem.It is important to understand the dynamics of bacterial community structure in recirculating aquaculture system during shrimp and shellfish rearing.In this study，bacterioplankton community structure in mangrove constructed wetland-mariculture coupling system was investigated by using high-throughput sequencing with 16S rDNA.High-throughput sequencing analysis indicated that the dominant OTUs were Proteobacteria，Cyanobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Actinobacteria and Planctomycetes.Proteobacteria and firmicutes were the most dominant phyla in mangrove wetland，while bacteroidetes and planctomycetes were the most abundant in shrimp pond.The analysis of Shannon-Wiener indices inferred that proteobacteria communities were the highest，whereas firmicutes were the lowest.The diversity of bacterial phyla in shrimp pond was lower than that of the other station（except firmicutes），whereas the diversity of bacterial phyla in mangrove wetland was higher than that of the other station（except actinobacteria）.Multidimensional scaling revealed the changes in the microbial community structure of different stations.The microbial community structure in shrimp pond was markedly different from other stations in recirculating mariculture system，suggesting that shrimp farming has a great influence on bacterioplankton community structure.

Key words:Bacterioplankton； Recirculating aquaculture system； Mangrove constructed wetland； High-throughput sequencing； 16S rDNA

中圖分類號：Q145+.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0557-08

doi:10.7541/2016.75

收稿日期：2015-07-10；

修訂日期：2015-12-14

基金項目：浙江省重大科技專項（2012C12017-3）； 國家貝類產業技術體系（CARS-48）； 國家蝦產業技術體系溫州綜合試驗站（CARS-47）； 浙江省科技計劃項目（2012F20029，2014F30025）； 溫州市科技計劃項目（2011N0006，S20130008）資助［Supported by the Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（2012C12017-3）； Zhejiang Mollusk Experiment Station，CARS（CARS-48）；Wenzhou Shrimp Experiment Station，CARS（CARS-47）； Zhejiang Science and Technology Project（2012F20029，2014F30025）；Wenzhou Science and Technology Project（2011N0006，S20130008）］

作者簡介：張翔（1982—），男，湖北黃石人； 博士； 主要研究方向為海水養殖微生物分子生態學。E-mail:jhon618@sohu.com

通信作者：閆茂倉，副研究員； E-mail:yanmaocang@126.com