文蛤HDAC1基因克隆、時空表達及生長相關SNP位點篩查

高曉艷 董迎輝 姚韓韓 林志華（浙江萬里學院，浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，寧波 315100）

文蛤HDAC1基因克隆、時空表達及生長相關SNP位點篩查

高曉艷 董迎輝 姚韓韓 林志華
（浙江萬里學院，浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，寧波 315100）

摘要：為探索HDAC1基因在文蛤生長發育中的作用，研究通過已構建的文蛤轉錄組文庫，利用SMART RACE技術擴增得到文蛤HDAC1（Mm-HDAC1）基因的cDNA全長序列，分析了其生物信息學、組織及發育階段表達特征，并用直接測序法在外顯子中篩查生長相關的SNP位點。結果顯示，Mm-HDAC1基因的cDNA全長3065 bp，開放閱讀框1599 bp，編碼532個氨基酸； 氨基酸序列比對發現，文蛤與其他物種同源性為74.3%—78.7%。熒光定量PCR（qRT-PCR）結果表明，Mm-HDAC1基因在文蛤6個組織中均有表達，其中外套膜中的表達量相對最高，并與其他組織間有極顯著差異（P<0.01）； 不同發育時期的表達差異結果表明，Mm-HDAC1基因在殼頂幼蟲期表達量最高，顯著高于其他發育時期（P<0.05）。SNP位點篩查結果表明，在Mm-HDAC1基因的外顯子區域發現了19個SNP位點，其中有3個SNP位點（627A>T、924T>C和1266T>C）與文蛤生長相關。

關鍵詞：文蛤； 組蛋白去乙酰化酶1； cDNA； 熒光定量； SNP

組蛋白去乙酰化酶1（Histone deacetylase 1，HDAC1）是HDACs家族中的重要一員，在卵母細胞成熟、胚胎發育、神經系統發生、骨骼分化、心臟發育、表皮分化、干細胞分化等過程中都發揮重要作用［1］。HDAC1是發現的第一個哺乳動物組蛋白脫乙酰化酶，推測其可能是基因轉錄的關鍵調節因子［2］，可介導位點特異DNA結合的轉錄抑制子［3］。在高等脊椎動物中，Sun等［4］純化并鑒定了雞HDAC1蛋白，劉峰等［5］、柳小春等［6］證明豬HDAC1基因與生長及胴體性狀相關，劉芳等［7］研究表明HDAC1與藏羚羊（Pantholops hodgsonii）的高原適應性可能有關，Pillai等［8］證明HDAC1基因與斑馬魚（Danio rerio）顱面軟骨及魚鰭的形成有關，李慧等［9］證明HDAC1基因在牙鲆（Paralichthys olivaceus）變態前以及變態階段均有表達。而在海洋貝類中，僅在泥蚶（Tegillarca granosa）中見有基因克隆及時空表達研究的報道［10］。

文蛤（Meretrix meretrix）作為我國重要的經濟養殖貝類之一，近些年來在分子遺傳和功能基因研究方面已經取得了重要研究進展。免疫相關基因的報道有血清補體C1q［11］、脂多糖誘導的腫瘤壞死因子（LITAF）［12］、銅鋅超氧化物歧化酶（SOB）［13］、金屬硫蛋白（MT）［14］、脂多糖和β-1，3葡聚糖結合蛋白（LGBP）［15］、富含半胱氨酸小腸蛋白（CRIP）［16］等；生長相關基因方面有鐵蛋白（Ferritin）［17］、組織蛋白酶B（Cathepsin B）［18］、磺基轉移酶（SULT）［19］和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶（FBA）［20］等，但HDAC1基因卻未見報道。本研究首次克隆獲得文蛤HDAC1（Mm-HDAC1）的cDNA全長，研究了其在不同組織、不同發育階段中的表達特征，并在基因外顯子中篩選與生長相關的SNP位點，以期為文蛤生長相關基因資源的挖掘利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

文蛤親貝取自寧波市鄞州區丹艷水產養殖基地，性腺發育成熟后進行催產，通過隔離產卵和人工授精技術獲得同步發育的未受精卵、受精卵、4細胞胚胎、囊胚、原腸胚、擔輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲和稚貝10個發育時期樣品，液氮速凍，存于-80℃冰箱，用于不同發育時期總RNA的提取。取3粒成貝，解剖取6個組織（外套膜、閉殼肌、內臟團、斧足、水管和鰓）樣品，用于不同組織總RNA提取。用于SNP位點篩選的文蛤自然群體共500粒，隨機取樣100粒，分別測量總重、殼寬、殼長和殼高等生長性狀，解剖取閉殼肌，液氮速凍，備用。

1.2 實驗方法

Mm-HDAC1基因cDNA全長克隆 用Trizol法提取文蛤閉殼肌總RNA，微量紫外分光光度儀檢測RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性。根據SMART RACE試劑盒（（Clontech）說明，合成cDNA第一鏈，用于全長cDNA 3′和 5′端序列快速擴增（RACE）的模板。根據文蛤轉錄組文庫（登錄號:SRA021052）的注釋信息，檢索到Mm-HDAC1基因的EST片段，據此分別設計3′-RACE和5′-RACE特異性引物HDAC1-F和HDAC1-R（表 1），采用touch down PCR，分別進行3′-和5′-RACE擴增。PCR產物進行割膠純化，純化產物與pMD18-T載體（TaKaRa）連接，并將重組質粒轉化到大腸桿菌DH-5α感受態細胞（TIANGEN）中，涂平板，進行藍白斑篩選，陽性克隆經菌液PCR鑒定后送上海桑尼生物技術有限公司測序。

為保證Mm-HDAC1基因cDNA全長的準確性，以拼接3′-和5′-RACE測序結果獲得的片段設計引物HDAC1-F1和HDAC1-R1，2×Taq MasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）進行PCR擴增，產物經割膠純化，連接轉化后測序，具體步驟同上。

Mm-HDAC1基因序列特征分析 將5′-RACE片段和3′-RACE片段序列進行拼接，用DNAMAN軟件預測氨基酸序列，并推測氨基酸基本理化性質； ORF Finder程序搜索開放閱讀框； 信號肽區域用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）預測； NetPhos2.0工具（http//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測氨基酸磷酸化位點； Prot Scale軟件（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質疏水性； TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預測蛋白質跨膜區； SMART 4.0（http://smart.emblheidel-berg.de/）預測蛋白結構域；Swiss Model軟件（http://swissmodel.expasy.org/ workspace/）預測蛋白質高級結構； MEGA 6.0軟件NJ法構建系統進化樹； Clustal X進行氨基酸多序列比對。

表 1 實驗所用引物及其序列Tab.1 Primers used in the study

Mm-HDAC1基因不同組織、不同發育時期的表達差異分析 Trizol法提取上述文蛤6個組織和10個發育時期樣品的總RNA，反轉錄合成cDNA。由已獲得的cDNA全長序列設計特異性引物Real-H-F和Real-H-R（表 1），18S rRNA 基因作為內參，利用ABI 7500Fast進行qRT-PCR，每個樣本做3個平行。數據處理采用相對值2-ΔΔCt進行計算，SPSS 20.0進行統計分析。

Mm-HDAC1基因外顯子SNP位點篩選 提取隨機取樣的100個文蛤樣品的總RNA，反轉錄合成cDNA。根據獲得的Mm-HDAC1基因的cDNA全長，設計3對特異性PCR引物HDAC1-F2和HDAC1-R2、HDAC1-F3 和HDAC1-R3、 HDAC1-F4和HDAC1-R4，以反轉錄合成的100個文蛤樣本的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR產物直接送公司測序。結果用MEGA6.0進行序列比對，查找SNP位點，按照突變位點相對于起始密碼子的位置分別命名，并用SPSS 20.0統計分析SNP位點與生長的相關性。

2 結果

2.1 Mm-HDAC1基因cDNA全長克隆

Mm-HDAC1基因cDNA全長3065 bp（GenBank登錄號:KP250877），開放閱讀框1599 bp，編碼532個氨基酸，5′UTR長35 bp，3′UTR為1431 bp，包含一個終止密碼子TAG，加尾信號AATAAA和26 bp的polyA尾巴。軟件預測顯示，Mm-HDAC1基因編碼蛋白質的分子量為60.16 kD，理論等電點為5.55，表現為親水性，沒有明顯的信號肽和跨膜區域。

SMART軟件預測顯示，Mm-HDAC1蛋白含有一段HDAC1高度保守的氨基酸序列（79 Ile-311Cys）。蛋白質高級結構預測顯示，Mm-HDAC1蛋白由17個α-螺旋和17個β-折疊片組成，β-折疊片基本平行排列，這種排列方式可能對維持蛋白的穩定性具有重要作用（圖 1）。NetPhos2.0軟件預測顯示，Mm-HDAC1蛋白有21個絲氨酸磷酸化位點，11個蘇氨酸磷酸化位點和9個酪氨酸磷酸化位點。

氨基酸多序列比對顯示，Mm-HDAC1基因與其他物種的同源性較高，為74.3%—78.7%，N端去乙酰化酶活性結構域（54Try-325Ala）與其他物種的同源性則高達92%以上（表 2）。從構建的系統進化樹來看，文蛤與同為無脊椎動物的紫色球海膽（Strongylocentrotus purpuratus）親緣關系較近，脊椎動物中的哺乳綱、鳥綱、兩棲綱和魚綱聚成一大支，與文蛤親緣關系較遠（圖 2）。

圖 1 文蛤Mm-HDAC1蛋白的二級結構預測

2.2 Mm-HDAC1基因在文蛤不同組織和不同發育時期的表達差異分析

利用qRT-PCR技術，檢測了Mm-HDAC1基因在6個組織和10個發育時期的時空表達特征。結果表明，Mm-HDAC1基因在文蛤6個組織中均有表達，其中外套膜中的表達量相對最高，并與其他組織之間有極顯著性差異（P<0.01），足中的表達量僅次于外套膜，與其他組織之間也有極顯著差異（P<0.01）（圖3）。

Mm-HDAC1基因在文蛤幼蟲的10個發育時期均有表達，從未受精卵開始表量呈逐漸上升的趨勢，在殼頂幼蟲中達到最高，并顯著高于其他發育時期（P<0.05），到眼點幼蟲和稚貝時期表達量降低，并與其他時期之間存在顯著差異（P<0.05），但兩組之間并無顯著差異（P>0.05）（圖 4）。

2.3 Mm-HDAC1基因外顯子SNP位點篩查與分析

表 2 文蛤Mm-HDAC1氨基酸序列與其他物種HDAC1的同一性比對Tab.2 Comparison of amino acid sequences of Mm-HDAC1 of M.meretrix with others

經序列比對，共篩查到19個SNP位點，將這些位點分別與生長性狀（總重、殼長、殼高、殼寬）進行相關性分析。結果發現，3個位點627A>T、924T>C和1266T>C與生長性狀顯著相關，其中位點627A>T 的AT型個體總重和殼寬均顯著高于AA型個體（P<0.05），位點924T>C的CC型個體殼寬顯著高于TT型個體（P<0.05），位點1266T>C的TC型個體殼寬顯著高于TT型個體（P<0.05），位點231T>G、255A>T/G、588A>T/C、591A>G、1114A>C、1158A>G、1194C>T、1221T>C、1266T>C、1281A>G和1356A>G中，雜合子的各生長性狀均高于純合子的平均值，但兩組數據間無顯著差異（P>0.05）（表 3）。

圖 2 用MEGA6.0軟件鄰接法構建的文蛤與其他物種HDAC1的系統進化樹

圖 3 Mm-HDAC1基因在文蛤不同組織中的表達差異分析

圖 4 Mm-HDAC1基因在文蛤不同發育時期的表達差異分析

3 討論

HDAC1基因可通過調節染色質結構和抑制特異性轉錄因子活性來調控細胞生長和分化，故在動物各個組織中均有表達。本研究通過qRT-PCR技術檢測了Mm-HDAC1基因在文蛤各組織中的表達情況，結果表明，Mm-HDAC1基因在各組織中均有表達，其中外套膜中表達量最高，文蛤外套膜是由內外兩層上皮細胞及其間的結締組織和肌肉纖維組成［21］，有研究表明HDAC1基因對哺乳動物上皮細胞分化起到很重要的作用［2 2］，因此推斷Mm-HDAC1基因在文蛤外套膜中上皮細胞的分化中發揮作用。另外Mm-HDAC1在足中表達量也很高，僅次于外套膜，并與其他組織間有顯著差異。有研究顯示，組蛋白乙酰化酶（HATs）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）以重塑染色質的方式直接或間接影響成肌分化抗原（MyoD）或肌細胞增強因子2（MEF2）及其下游基因的表達，進而調節肌肉的生肌過程［23，24］，而文蛤足中肌肉含量很高，導致HDAC1在該組織中大量表達。

HDAC1基因在多種動物胚胎發育中的表達情況都有研究，研究表明幾乎在所有物種的早期胚胎中都有表達。敲除HDAC1基因或HDAC1碳末端發生突變，都會導致小鼠早期胚胎發育異常，表現為胚胎生長阻滯、頭部和尿囊發育異常，胚胎在妊娠10.5d死亡［25，26］，說明HDAC1基因在生物的發育過程中發揮著重要的作用。本研究結果表明，Mm-HDAC1基因在各發育時期中均有表達，在未受精的卵子中就有表達，說明HDAC1基因是母源性的，Dufourcq等［27］在模式動物線蟲的早期胚胎發育過程中發現HDAC1基因是母源的，胚胎基因組開始轉錄時就能檢測到。而在研究動物后期胚胎發育的過程中，發現HDAC1基因在果蠅、斑馬魚、兩棲動物的頭部區域，包括中樞神經系統和大腦發育過程中都有所表達［28—30］。Mm-HDAC1基因在文蛤殼頂幼蟲時期表達量達到最高，可能是殼頂幼蟲時期是文蛤快速生長的時期，細胞分裂和組織器官分化速度加快，生命活動旺盛［31］，需要更多HDAC1基因來調節胚胎發育過程中的基因轉錄。到眼點幼蟲和稚貝時期，Mm-HDAC1的表達量又逐漸下降，可能是由于此時文蛤各組織、器官已基本形成，Mm-HDAC1基因的表達量逐漸達到穩定。

表 3 不同基因型文蛤的生長性狀Tab.3 Growth traits of M.meretrix with different genotypes

續表

本研究利用直接測序的方法在Mm-HDAC1基因的外顯子區域共篩查到19個SNP位點，3個位點（627A>T、924T>C 和1266T>C）與生長性狀有相關性，其中位點627A>T 的AT型個體總重、殼寬和殼高均顯著高于AA型個體（P<0.05），位點924T>C的CC型個體殼寬顯著高于TT型個體（P<0.05），位點1266T>C的TC型個體殼寬顯著高于TT型個體（P<0.05），提示HDAC1基因可能是貝類生長相關的潛在基因。有研究表明，在杜洛克豬種的HDAC1基因中，GG基因型的生長速度和生長性能指數明顯優于AA型，等位基因G對生長具有正效應［5］。進一步分析發現，位點627A>T和924T>C位于Mm-HDAC1的乙酰化酶活性結構區域，該位點的突變可能與HDAC1發揮其活性有關，但其具體機制還需進一步深入研究。

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CLONING，SPATIOTEMPORAL EXPRESSION AND SNPS IDENTIFICATION OF HDAC1 GENE IN HARD CLAM MERETRIX MERETRIX

GAO Xiao-Yan，DONG Ying-Hui，YAO Han-Han and LIN Zhi-Hua
（Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resource of Zhejiang，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Abstract:Mm-HDAC1 cDNA was cloned by SMART RACE techniques using 454 cDNA library of Meretrix meretrix.The bioinformatics and expression profiles in different tissues and developmental stages were analyzed，and SNPs were screened.The results indicated that the full length cDNA of Mm-HDAC1 gene was 3065 bp，containing a complete 1599 bp ORF that encodes 532 amino acids.Comparison of animal acid sequence，M.meretrix shared 74.3%—78.5% identity with others，suggesting that Mm-HDAC1 was highly conservative.The result of qRT-PCR showed that Mm-HDAC1 expressed in all six tissues，and its expression was significantly higher in mantle than other tissues（P<0.01）.Moreover，the expression of Mm-HDAC1 gradually increased with the process of the development with the highest level in umbo larvae stage（P<0.01）.19 SNPs in exons of Mm-HDAC1 were identified and 3 SNPs were potentially associated with M.meretrix growth（627A>T，924T>C and 1266T>C）.

Key words:Meretrix meretrix； Histone deacetylase1（HDAC1）； cDNA； qRT-PCR； SNP

中圖分類號：Q785； S968.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0601-08

doi:10.7541/2016.81

收稿日期：2015-07-14；

修訂日期：2015-12-20

基金項目：國家自然科學基金項目（31372527）； 國家現代貝類產業技術體系項目（CARS-48）； 浙江省重大科技專項（2012C12907-4）； 國家水產種質資源平臺項目（2015DKA30470）資助［Suppprted by National Natural Science Foundation of China（31372527）； Modern Agro-industry Technology Research Systerm（CARS-48）； Zhejiang Major Program of Science and Technology（2012C12907-4）and National Infrastructure of Fishery Germplasm Resource Programme（2015DKA30470）］

作者簡介：高曉艷（1989—），女，河南安陽人； 碩士研究生； 主要從事海洋貝類遺傳育種研究。E-mail:yanyuninan6264@163.com

通信作者：董迎輝（1980—），副研究員； 碩導； 主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail:dongyinghui118@126.com； 林志華（1965—），研究員；博導； E-mail:zhihua9988@126.com