應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者共有拷貝數(shù)變異的初步研究

周慧　何丹　楊學(xué)習(xí)　李粉霞

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應(yīng)用微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者共有拷貝數(shù)變異的初步研究

周慧1何丹2楊學(xué)習(xí)1李粉霞2

［摘要］目的探討乳腺癌患者基因組中共有的拷貝數(shù)變異與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為乳腺癌的預(yù)防、治療和預(yù)后提供基本依據(jù)。方法使用微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)樣本基因組DNA的拷貝數(shù)變異。將得到的拷貝數(shù)變異在人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行變異分析，尋找樣本共有的拷貝數(shù)變異并分析其與乳腺癌的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1q21、8p11、8p12、8q11、14q32、14q32.33（其中包含2個(gè)片段），20q13和22q11共9個(gè)共有拷貝數(shù)變異，其中4個(gè)拷貝數(shù)變異通過人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)為正常多態(tài)性拷貝數(shù)變異。有5個(gè)拷貝數(shù)變異在人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在相似片段并且在孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)中有致病基因，包括4個(gè)擴(kuò)增片段和1個(gè)缺失片段。結(jié)論1q21.1q42.2、8q21.12q23.3和20q13.2q13.31 3個(gè)片段的擴(kuò)增及8p12p11.23的缺失與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有一定聯(lián)系，但8q11.22q11.23的擴(kuò)增與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

［關(guān)鍵詞］乳腺癌；拷貝數(shù)變異；微陣列比較基因組雜交

作者單位：1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515
2.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球呈明顯的上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著廣大婦女的身體健康。盡管我國(guó)女性乳腺癌總體發(fā)病率在世界范圍處于中低水平［1］，但隨著工業(yè)化的發(fā)展、人們生活方式的變化，乳腺癌總發(fā)病率在不斷提高，特別是在較發(fā)達(dá)城市如北京、上海、天津、廣州等，乳腺癌已成為婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤［2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心（Inter?national Agency for Research on Cancer，IARC）統(tǒng)計(jì)，2008年中國(guó)女性乳腺癌標(biāo)化發(fā)病率為21.6/ 100 000，在全球184個(gè)有統(tǒng)計(jì)資料的國(guó)家中位列第99位，標(biāo)化死亡率為5.7/100 000，位列第145位，均顯著低于世界平均水平［2］。但是由于人口基數(shù)大，卻占世界新診斷乳腺癌的12.2%，死亡例數(shù)占世界乳腺癌死亡人數(shù)的9.6%［3］。如何進(jìn)行早期預(yù)防并降低乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)成為乳腺腫瘤研究中的重大現(xiàn)實(shí)課題。

乳腺癌是一種遺傳異質(zhì)性腫瘤，臨床上根據(jù)免疫組化檢測(cè)ER、PR、HER2和Ki67的結(jié)果，將乳腺癌劃分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER?2陽性和三陰性乳腺癌。各亞型與乳腺癌的疾病轉(zhuǎn)歸、患者預(yù)后和治療反應(yīng)密切相關(guān)。不同亞型的乳腺癌在總生存期和無復(fù)發(fā)生存期上存在顯著差異，其中Luminal A型的預(yù)后較好，而三陰性乳腺癌的預(yù)后交差。但目前臨床上免疫組化檢測(cè)沒有統(tǒng)一的檢測(cè)和評(píng)估規(guī)范，很難確切的進(jìn)行分子分型。早在2000年，Perou等［4］就嘗試采用基因芯片的方式將乳腺癌分成不同的亞型。根據(jù)基因表達(dá)譜，可以把乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、HER?2陽性和基底樣乳腺癌。其中大部分基底樣乳腺癌是三陰性乳腺癌。基于芯片表達(dá)譜的分子分型更易進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)和評(píng)估。除此以外，芯片還可以檢測(cè)到其他癌基因或者抑癌基因的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNVs）。這些在人類基因組中廣泛存在的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜位點(diǎn)的變異，長(zhǎng)度為1 kb以上，其突變率遠(yuǎn)高于單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）。這些特異的變異可以成為潛在的治療靶標(biāo)。例如，AKT1和FGFR1在乳腺癌變異和擴(kuò)增的頻率分別為4%和10%，對(duì)特定的抑制劑靶向治療敏感［5-6］。對(duì)這些靶向變異位點(diǎn)的掃描可以幫助我們找到靶向治療的特定受益人群。微陣列比較基因組雜交（array?based comparative genomic hybrid? ization，aCGH）用DNA探針取代了細(xì)胞中期染色體，可以檢測(cè)基因組DNA在相應(yīng)的序列或基因上的拷貝數(shù)變異［7］，一次檢測(cè)相當(dāng)于對(duì)基因組同時(shí)進(jìn)行了成千上萬個(gè)獨(dú)立的熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。然而，aCGH無法檢測(cè)不導(dǎo)致CNVs的染色體畸變，如點(diǎn)突變、平衡易位和倒位等［7］。Pollack［8］用aCGH的方法在乳腺癌中不僅證實(shí)了比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）探測(cè)到的17q和20q上的擴(kuò)增區(qū)域，而且新發(fā)現(xiàn)了1q、8q、11q和15q擴(kuò)增區(qū)域，3p、6q、9p、10q和Xq缺失區(qū)域［9］。這些片段上含有很多與乳腺癌相關(guān)的基因。

本實(shí)驗(yàn)擬用aCGH檢測(cè)中國(guó)人群乳腺癌患者的全基因組DNA，尋找與分析乳腺癌共有的CNVs并探討這些CNVs與中國(guó)人群乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，期望為乳腺癌的預(yù)防、治療和預(yù)后提供基本檢測(cè)方法和技術(shù)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1病例資料

樣本為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院乳腺中心收治的4名漢族女性患者，年齡分別為40歲、57歲、56歲、59歲，平均年齡為53歲。樣本均為左側(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，根據(jù)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis，TNM）分期，原發(fā)腫瘤體積不大于5 cm，除3號(hào)樣本無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之外，其他均有一定程度區(qū)域淋巴結(jié)侵犯。所有樣本均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2芯片檢測(cè)共有CNVs

安捷倫aCGH試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，1×TE（pH 8.0）、Molecular grade來自美國(guó)Pro?mega公司，SureScan Microarray Scanner、Hybridiza?tion Oven、CytoGenomix和CytoGenomics Edition分析軟件來自美國(guó)Agilent公司。

使用QIAamp DNA Mini Kit提取組織中的基因組DNA，用Thermo NanoDrop2000C紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)量提取DNA的濃度和純度。要求2.0〉260/280〉1.8，260/230〉1.0。分別取0.5 μg樣本DNA量和reference量到反應(yīng)管中，加水至13 μ L。加入隨機(jī)引物2.5 μ L，然后進(jìn)行片段化和單鏈化。隨后冰上配制Cy3和Cy5 2種染料的標(biāo)記混合液，每管加入9.5 μ L的標(biāo)記控制混合液后孵育標(biāo)記。用純化柱子對(duì)標(biāo)記后的DNA進(jìn)行純化，然后使用NanoDrop 2000 UV?VIS分光光度計(jì)來檢測(cè)并計(jì)算產(chǎn)量與比活度。制備Hybridization Mas?ter Mix，將標(biāo)記的被測(cè)和對(duì)照樣品混勻加29 μ L到每管混合物后孵育。使墊圈滑片和雜交室底部磨合和對(duì)齊，將雜交樣本混合液40 μ L放在墊圈的中央，放上有活性的芯片，后封閉雜交室。將雜交室放入雜交箱，配平，20 rpm，67℃，24 h。從雜交箱拿出雜交盒，取出芯片進(jìn)行洗滌。

1.3芯片掃描和數(shù)據(jù)分析

芯片用SureScan Microarray Scanner進(jìn)行掃描，用Agilent CytoGenomics Edition進(jìn)行分析得到CNVs。得到所有樣本全部CNVs后，篩選4例樣本共有CNVs，通過查詢DGV（database of genomic variants）數(shù)據(jù)庫(kù)、線上《人類盂德爾遺傳》（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)和查找相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得片段進(jìn)行研究。

2　結(jié)果

2.1乳腺癌共有CNVs

4個(gè)乳腺癌樣本共發(fā)現(xiàn)CNVs總數(shù)為295個(gè)，其中2號(hào)樣本有82個(gè)，1號(hào)、3號(hào)和4號(hào)樣本均為71個(gè)（圖1）。發(fā)現(xiàn)9個(gè)共有CNVs，包括2個(gè)純和擴(kuò)增（8p11.23p11.22和22q11.22），6個(gè)雜合擴(kuò)增（1q21.1q42.2，8q11.22q11.23，8q21.12q23.3，14q32.33中的2個(gè)片段和20q13.2q13.31）和1個(gè)雜合缺失（8p12p11.23），片段變異范圍為117 kb～84 684 kb，包含基因個(gè)數(shù)為1個(gè)～152個(gè)基因。

2.2數(shù)據(jù)庫(kù)查找結(jié)果

通過查詢DGV數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)檢索對(duì)實(shí)驗(yàn)所得片段進(jìn)行分析。在發(fā)現(xiàn)的9個(gè)共有CNVs中，4個(gè)共有CNVs為正常多態(tài)性CNVs，為無關(guān)CNVs；5個(gè)共有CNVs是致病性CNV，包括1q21.1q42.2、8q11.22q11.23、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這4個(gè)片段的擴(kuò)增和8p12p11.23的缺失（表1）。

3　討論

隨著乳腺癌發(fā)病率的持續(xù)增長(zhǎng)，人們對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究愈發(fā)迫切。在眾多發(fā)病因素當(dāng)中，基因拷貝數(shù)的變異是重要致病因素之一，通過對(duì)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)可了解基因狀態(tài)以及研究一些未知的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)用aCGH的方法一次檢測(cè)整個(gè)基因組基因的拷貝數(shù)變異，得到整個(gè)基因組所有的拷貝數(shù)變異片段后，尋找4個(gè)樣本共有的CNVs，通過數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和利用收集的資料對(duì)這些片段進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例樣本的共有CNVs 9個(gè)，其中：8p11.23p11.22、14q32.33中的2個(gè)片段和22q11.22在DGV數(shù)據(jù)庫(kù)中存在相似片段，是正常多態(tài)性CNVs，可判斷為無關(guān)CNVs。在DGV數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有相似片段的CNVs有1q21.1q42.2、8q11.22q11.23、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這4個(gè)片段的擴(kuò)增和8p12p11.23的缺失，共5個(gè)CNVs，并且所有這些片段在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中都存在致病基因。

片段1q21.1q42.2里共包含的基因有572個(gè)，其中包括了3個(gè)1qETS（E?twenty six）家族。ETS是轉(zhuǎn)錄因子家族中的最大的家族之一，是后生動(dòng)物所特有的。ETS家族有很多功能，包括細(xì)胞分化的調(diào)控、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管生成等。許多ETS都被證實(shí)與癌癥有關(guān)，基因拷貝數(shù)增加是一種致癌基因激活的替代機(jī)制。經(jīng)研究表明，在乳腺癌當(dāng)中，1q擴(kuò)增是最常見的拷貝數(shù)變異［10］。Mesquita等［10］通過染色體CGH評(píng)估141乳腺癌全基因組拷貝數(shù)變異，顯示1q21和1q32是2個(gè)基因拷貝數(shù)增加最頻繁的染色體帶。他們通過FISH證實(shí)了1q擴(kuò)增，展示了基因拷貝數(shù)增加的ETS基因：ETV3（位于1q21q23），ELF3和ELK4（兩者都位于1q32）。用實(shí)時(shí)定量PCR評(píng)估3個(gè)1qETS基因表達(dá)水平以及其靶基因MYC和CRISP3，展示乳腺癌1q21和1q32的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增與ETS轉(zhuǎn)錄因子ETV3和ELF3在這些位點(diǎn)過表達(dá)有關(guān)。3個(gè)ETS基因中，ELF3與乳腺癌發(fā)生相關(guān)，可能是導(dǎo)致1q拷貝數(shù)增加的效應(yīng)因子［10］。利用包括CGH的傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)技術(shù)，可以識(shí)別乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤的拷貝數(shù)變異常發(fā)生的區(qū)域。這些CNVs當(dāng)中，包含已知的或候選的癌基因、一些腫瘤抑制基因以及相關(guān)基因，如1q、8q22的擴(kuò)增和8p的缺失［8］。Yang等［11］研究也表明在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)8q24、20q13、11q12和8p12?p11基因區(qū)域擴(kuò)增。絕大多數(shù)的乳腺癌（80%）1q、8q單獨(dú)擴(kuò)增或兩者兼而有之，也可能出現(xiàn)3種變化（+ 1q，+8q或?13q），占腫瘤的91%［12］。本實(shí)驗(yàn)所得到的共有CNV中，8p12p11.23的缺失和8q21.12q23.3的擴(kuò)增與以上研究報(bào)道的結(jié)果一致，因此我們推斷這2個(gè)片段的拷貝數(shù)變異與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

表1　乳腺癌樣本共有CNVsTable 1 The common CNVs in the breast cancer samples

在目前報(bào)道的拷貝數(shù)變異與乳腺癌相關(guān)關(guān)系的研究中，較少提及8q11.22q11.23片段。但我們查找OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)這個(gè)片段內(nèi)有一個(gè)致病基因存在：視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1誘導(dǎo)卷曲蛋白（RB1?inducible coiled?coil 1, RB1CC1）基因。RB1CC1基因作用在細(xì)胞周期進(jìn)程，和TSC1?TSC2形成腫瘤抑制復(fù)合體。RB1CC1可能是RB1表達(dá)的上游調(diào)節(jié)器，在乳腺癌中是一個(gè)抑癌基因，它的純合失活可能參與乳腺癌腫瘤發(fā)生［13］。Chano等［13］研究發(fā)現(xiàn)，20%的原發(fā)性乳腺癌中檢測(cè)到RB1CC1基因存在突變。在有RB1CC1突變的癌癥患者中，野生型RB1CC1和RB1缺失或少于正常，在沒有發(fā)生該類突變的癌癥患者中卻比較富余［13］。因此我們推測(cè)實(shí)驗(yàn)樣本中RB1CC1基因未發(fā)生突變，野生型RB1CC1比正常多。所以片段8q11.22q11.23的擴(kuò)增與乳腺癌發(fā)生發(fā)展也許有一定關(guān)系，具體關(guān)系的闡明有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)得到的20q13.2q13.31片段中包含18個(gè)基因，其中包含了鋅指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）基因。ZNF217編碼選擇性剪接Kruppel樣DNA轉(zhuǎn)錄因子、DNA結(jié)合域組成成分和脯氨酸轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，被普遍認(rèn)為是參與乳腺癌腫瘤發(fā)生的癌基因。鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以選擇性的結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，使鋅指蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)ZNF217過表達(dá)時(shí)能使人乳腺表皮細(xì)胞無限增殖。

20q13.2區(qū)域的擴(kuò)增是乳腺癌的一個(gè)早期事件，與侵略性的腫瘤行為、永生化和基因組不穩(wěn)定性有關(guān)［14］。用CGH的方法檢測(cè)到的20號(hào)染色體長(zhǎng)臂的擴(kuò)增，共有出現(xiàn)在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中［15］。Wer?ner等［14］人的研究首次描述了一個(gè)擴(kuò)增的染色體區(qū)域20q13，這個(gè)片段里包含公認(rèn)的致癌基因出現(xiàn)在管內(nèi)增生（intraduct hyperplasia，IH）的進(jìn)程中。在同樣本中非典型導(dǎo)管增生（atypical duct hyper?plasia，ADH）、原位管癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）中也出現(xiàn)20q13擴(kuò)增，暗示IH和IDC的相關(guān)聯(lián)系［14］。20q13.2區(qū)域的擴(kuò)增可能會(huì)刺激正常上皮以加速細(xì)胞增殖和導(dǎo)管增生，加上基因變化，包括20 q13.2從低擴(kuò)增向高擴(kuò)增的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)腫瘤形成，即20q13擴(kuò)增促進(jìn)從腫瘤初期（IH）到后階段（DCIS，IDC）的致癌作用［14］。本實(shí)驗(yàn)的樣本全取自左側(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的癌組織，掃描后所得結(jié)果顯示20q13擴(kuò)增出現(xiàn)頻率為100%。

通過芯片掃描結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和相關(guān)文獻(xiàn)檢索，1q21.1q42.2、8q21.12q23.3、20q13.2q13.31這3個(gè)片段的擴(kuò)增以及8p12p11.23的缺失與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展可能有一定聯(lián)系，8q11.22q11.23的擴(kuò)增與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚有待一進(jìn)步驗(yàn)證。由于本研究樣品較少，后續(xù)需要加大樣本量對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

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論著

Preliminary study of common copy number variations of breast cancer patients detected by array?based comparative genomic hybridization technology

ZHOU Hui1，HE Dan2，YANG Xuexi1，LI Fenxia2
（1. School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515；
2. Guangzhou Darui Biotechnology Co. LTD，Guangzhou，Guangdong，China，510665）

［ABSTRACT］Objective To explore associations between the common copy number variations (CNVs) in breast cancer patients and the occurrence and development of breast cancer, which may provide the foundation to study the prevention, treatment and prognosis of breast cancer. Methods CNVs of genomic DNA were obtained by array?based comparative genomic hybridization techniques. Then the CNVs were analyzed in terms of the Database of Genomic Variants and Online Mendelian Inheritance in Man, revealing a relationship between common CNVs and breast cancer. Results In 4 breast cancer samples, 9 common copy number variations 1q21, 8p11, 8p12, 8q11, 14q32, 14q32.33(including 2 CNVs), 20q13 and 22q11 were selected out. And 4 of them were confirmed as normal polymorphism copy number variations. While the remaining 5 CNVs were, including 4 amplification and 1 loss, could not be identified through the Database of Genomic Variants and Online Mendelian Inheritance in Man. Conclusion Amplified 1q21.1q42.2, 8q21.12q23.3, 20q13.2q13.31 and loss of 8p12p11.23 may be associated with the occurrence and development of breast cancer. The connections between amplifications of 8q11.22 q11.23 and breast cancerstill needs furtherverification.

［KEY WORDS］Breast cancer；Copy numbervariation；Array?based comparative genomichybridization

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81302327）；廣州市科技計(jì)劃攻關(guān)項(xiàng)目（2060404）

通訊作者：李粉霞，E?mail：lifenxia123@gmail.com