乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽體的表達(dá)與特異性鑒定

楊姣姣，張瑩，沈宇清，王潔，付波，張建瓊

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京　210009)

乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽體的表達(dá)與特異性鑒定

楊姣姣，張瑩，沈宇清，王潔，付波，張建瓊

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京210009)

[摘要]目的：構(gòu)建pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)BRBP1- Fc肽體，并驗(yàn)證其與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(231- BR)的結(jié)合特異性。方法：合成帶有EcoRⅠ、NcoⅠ酶切位點(diǎn)的腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌特異性肽BRBP1片段，利用該雙酶切位點(diǎn)將其定向插入pFUSE- hIgG2- Fc2質(zhì)粒，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞真核表達(dá)BRBP1- Fc肽體，用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光等方法證實(shí)BRBP1- Fc肽體與231- BR細(xì)胞結(jié)合特異性。結(jié)果：成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到BRBP1- Fc肽體的表達(dá)，分子質(zhì)量約為37 kDa，并且證實(shí)BRBP1- Fc肽體與231- BR細(xì)胞特異性結(jié)合。結(jié)論：成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1,表達(dá)了BRBP1- Fc肽體，并鑒定了其與231- BR細(xì)胞的結(jié)合特異性。

[關(guān)鍵詞]肽體； 真核表達(dá)； 乳腺癌； 腦轉(zhuǎn)移

自1989年構(gòu)建CD4- Fc融合蛋白來(lái)阻止人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)攻擊T細(xì)胞以來(lái)，F(xiàn)c融合蛋白的應(yīng)用得到越來(lái)越多的關(guān)注[1]。Fc融合蛋白是由肽或蛋白與免疫球蛋白(IgG)的Fc段鉸鏈區(qū)融合而成，最早由Amgen公司命名為肽體。肽體整合了肽或蛋白的固有功能以及IgGFc段的結(jié)合特性，具有重要的生物學(xué)功能。

我們?cè)谇捌诠ぷ髦欣脤?zhuān)一性腦轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系231- BR[2]，通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)全細(xì)胞篩選技術(shù)獲得與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的肽BRBP1[3]，在充分驗(yàn)證其結(jié)合特異性的基礎(chǔ)上，利用該肽進(jìn)行了分子成像和靶向遞送抗腫瘤藥物的研究，結(jié)果均顯示出良好的成像及治療效果[4]。在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)構(gòu)建 pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1真核表達(dá)載體[5]，表達(dá)BRBP1- Fc肽體并鑒定其與231- BR細(xì)胞的結(jié)合特異性，為尋找BRBP1肽的受體以及進(jìn)一步研究BRBP1的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)為作者所在實(shí)驗(yàn)室制備，293T細(xì)胞、231- BR、MCF- 7乳腺癌細(xì)胞系及pFUSE- hIgG2- Fc2質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑

T4 DNA連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ、NcoⅠ)購(gòu)于NEB 公司；胎牛血清 (FBS)、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；多聚甲醛 (PFA)、DAPI 核酸染料購(gòu)自Sigma- Aldrich 公司；胰蛋白酶購(gòu)自AMRESCO 公司；瓊脂粉購(gòu)自O(shè)XOID 公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自AMRESCO公司；引物合成、DNA Polymerase在上海捷瑞公司；DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；DNA測(cè)序在上海華大基因有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司；DNA電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech公司；胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID 公司；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；小鼠抗人Fc單抗購(gòu)自Fitzgerald公司；超濾管購(gòu)自Merck Millipore公司。其余未特殊注明的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3設(shè)計(jì)與合成目的片段

合成帶有EcoRⅠ、NcoⅠ酶切位點(diǎn)的BRBP1目的片段，正義鏈序列為5′- AATTCGGGTGGAGGTATGTAT CCTTGGACGGAGCCTAGTTATCTTTCTAATGGTGGAGG TTCGCC- 3′，反義鏈序列為5′- CATGGGCGAACCTCCA CCATTAGAAACATAACTATTCTCCGTCCAAGACTACAT ACCTCCACCCG- 3′。將二者等比例混合均勻，于100 ℃水浴鍋中變性10 min后自然冷卻至室溫。

1.4構(gòu)建pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1表達(dá)質(zhì)粒

將pFUSE- hIgG2- Fc2載體與合成的BRBP1目的片段分別用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切，凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個(gè)片斷用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)菌落接種于含博來(lái)霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜。用質(zhì)粒試劑盒抽提質(zhì)粒，用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切初步鑒定外源基因的插入，同時(shí)質(zhì)粒DNA送上海華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系

用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞鋪于6孔板至70%～80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine?2000 Transfection Reagent試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將重組質(zhì)粒以及空載分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，后者所表達(dá)的Fc蛋白作為陰性對(duì)照。

為了提高建筑的防水效果，避免屋頂和墻壁上的水接觸后出現(xiàn)裂縫和漏水，建筑施工企業(yè)在進(jìn)行防水工作時(shí)需要再次創(chuàng)新，提高材料的防水效果。目前，我國(guó)房屋施工中的屋面防水工程采用聚合物水泥地基復(fù)合涂料施工技術(shù)，有效實(shí)現(xiàn)了技術(shù)創(chuàng)新，提高了房屋墻體和屋面的防水性能。

1.6蛋白收集與蛋白質(zhì)印跡法鑒定

轉(zhuǎn)染6 h后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含F(xiàn)BS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞上清。用超濾管將上清濃縮至300 μl左右，取10 μl用于蛋白質(zhì)印跡鑒定。將濃縮蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用 5%BSA常溫封閉2 h，加入鼠抗人Fc 抗體(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜5次，每次8 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠 IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次8 min。ECL顯色觀察結(jié)果。

1.7ELISA

用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)231- BR細(xì)胞、MCF- 7細(xì)胞，細(xì)胞鋪于96孔板至80%融合時(shí)分別加Fc蛋白、BRBP1- Fc蛋白和稀釋10、100倍的蛋白孵育，每個(gè)濃度各3個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育2 h。加入HRP- 兔抗人IgG Fc抗體(1∶500)，37 ℃孵育1 h。加入100 μl·孔-1TMB 顯色10 min，加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450吸光度。

1.8細(xì)胞免疫熒光競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞按 5×104孔-1密度接種于24 孔板(內(nèi)置細(xì)胞爬片)，培養(yǎng)至70%～80%融合；加入熒光標(biāo)記肽BRBP1- (5- TAMRA) 和BRBP1- Fc蛋白的混合物，保持熒光肽濃度不變(5 μmol·L-1)，BRBP1- Fc蛋白濃度梯度增加(5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2μmol·L-1)37 ℃，30 min；加入4% PFA，室溫固定20 min；DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色，封片觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，定量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析(one- way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1BRBP1- Fc重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1用EcoRⅠ、NcoⅠ雙酶切得到約4 200 bp條帶(BRBP1大小48 bp，片段過(guò)小，故不能從圖中看見(jiàn))，如圖1示，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，與NCBI- Blast比對(duì)可知序列正確，構(gòu)建成功。

M.上海捷瑞公司rDL10004- 100；BRBP1- Fc.重組質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

圖1重組質(zhì)粒pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1酶切分析

M.Shanghai Generay Biotech CO. (rDL10004- 100)；BRBP1- Fc.recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

Fig 1Restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

分別將pFUSE- hIgG2- Fc2空載和pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收集上清蛋白，使用抗Fc單抗鑒定肽體的表達(dá)。如圖2示，F(xiàn)c蛋白大小約35 kDa，BRBP1- Fc蛋白大小約37 kDa，表明構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)。

2.3BRBP1- Fc蛋白與231- BR 細(xì)胞系結(jié)合特異性鑒定

2.3.1ELISA方法檢測(cè)結(jié)合特異性從前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，BRBP1與腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞231- BR細(xì)胞

M.Fermentas公司蛋白分子質(zhì)量標(biāo)記；control.無(wú)任何轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞上清；Fc.轉(zhuǎn)染pFUSE- hIgG2- Fc2空質(zhì)粒的上清；BRBP1- Fc.轉(zhuǎn)染pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1重組質(zhì)粒的上清

圖2蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Fc蛋白和BRBP1- Fc蛋白的表達(dá)

M.Protein ladder from Fermentas; control.cell supernatant without transfection; Fc.cell supernatant transferred with plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2; BRBP1- Fc.cell supernatant transferred with recombinant plasmid pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1

Fig 2Western blotting analysis of Fc protein and BRBP1- Fc peptibody

特異性結(jié)合，與自發(fā)轉(zhuǎn)移潛能很低的乳腺癌細(xì)胞系MCF- 7細(xì)胞不結(jié)合[3]。本實(shí)驗(yàn)利用ELISA方法檢測(cè)BRBP1- Fc肽體和231- BR、MCF- 7細(xì)胞的結(jié)合情況。如圖3所示，與對(duì)照組Fc蛋白相比，BRBP1- Fc肽體和231- BR細(xì)胞呈現(xiàn)特異性結(jié)合(1.118±0.08vs. 0.346±0.097，P<0.01);與MCF- 7細(xì)胞相比，BRBP1- Fc肽體和231- BR細(xì)胞呈現(xiàn)特異性結(jié)合 (1.118±0.08vs. 0.360±0.059，P<0.01)。并且，BRBP1- Fc肽體與231- BR呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性的結(jié)合。以上結(jié)果均表明，BRBP1- Fc蛋白保留了BRBP1的結(jié)合特異性，即與231- BR細(xì)胞特異性結(jié)合，與MCF- 7細(xì)胞不結(jié)合。

2.3.2競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光法檢測(cè)結(jié)合特異性通過(guò)BRBP1- Fc肽體競(jìng)爭(zhēng)BRBP1- (5- TAMRA)與231- BR細(xì)胞的結(jié)合，檢測(cè)肽體和231- BR細(xì)胞的結(jié)合特異性。如圖4所示，在熒光肽濃度不變的情況下，隨著肽體濃度的升高熒光信號(hào)逐漸減弱，這表明BRBP1- Fc肽體可有效競(jìng)爭(zhēng)抑制BRBP1- (5- TAMRA)與231- BR細(xì)胞的結(jié)合。

3討論

低分子質(zhì)量多肽在疾病的診斷、治療等生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，多肽分子由于其分子質(zhì)量小、組織滲透性好、免疫原性弱和半衰期短等特點(diǎn)使其成為構(gòu)建分子影像探針的良好選擇。基于靶向性多肽構(gòu)建的分子探針可用于人體光學(xué)分子成像、磁共振分子成像等多種成像模式。例如，Sturm等將靶向性多肽ASY連接熒光基團(tuán)FITC后用于人食管癌熒光分子成像[6]；Pilch等將肽段偶聯(lián)Gd 劑構(gòu)建磁共振分子

aP<0.05

圖3ELISA方法檢測(cè)BRBP1- Fc肽體和231- BR細(xì)胞的特異性結(jié)合

Fig 3ELISA analysis of binding specificity of BRBP1- Fc peptibody with 231- BR cells

圖4細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)BRBP1- Fc肽體和231- BR細(xì)胞的特異性結(jié)合

Fig 4Immunofluorescence analysis of binding specificity of BRBP1- Fc peptibody with 231- BR cell

成像探針CREKA- dL- (DOTA- Gd)，成功用于人的前列腺癌的T1加權(quán)成像及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊成像[7]。除成像之外，靶向多肽分子還可用于人類(lèi)疾病治療。作為胰高血糖素樣肽- 1受體的激動(dòng)劑(Byetta?， Amylin Pharmaceuticals， Inc.)治療2型糖尿病；作為促性腺激素受體的激動(dòng)劑(Zoladex?， AstraZeneca; Lupron?， Abbott)來(lái)治療前列腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥[1]。盡管如此，由于肽屬于小分子物質(zhì)，容易被分解代謝，分子半徑小于腎小球?yàn)V過(guò)膜孔徑，可被快速降解排出體外，嚴(yán)重影響了多肽在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。針對(duì)這一不足，目前已研發(fā)出很多方法來(lái)提高肽的穩(wěn)定性及藥代動(dòng)力學(xué)特征[8]，其中就包括將肽與IgG的Fc片段融合表達(dá)，也就是表達(dá)肽體，在保持多肽結(jié)合特異性的基礎(chǔ)上提高其在體內(nèi)的半衰期，降低腎清除率[9]。此外，融合有Fc段的肽體可以和免疫細(xì)胞表面的Fc受體相互作用，繼而調(diào)動(dòng)免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，對(duì)疾病的治療和疫苗的研發(fā)尤為重要[10]。總之，從生物物理角度來(lái)講，親水性的IgG- Fc片段增加了肽體的溶解性、穩(wěn)定性；多肽的二聚體結(jié)構(gòu)使其親合力也明顯增加；從技術(shù)上來(lái)看，肽體可通過(guò)protein- G/A親和層析，簡(jiǎn)單、有效地純化以利于后續(xù)大量生產(chǎn)。至2011年，已經(jīng)有6種基于肽體的藥物成功上市，有4種藥物正處于臨床3期實(shí)驗(yàn)階段，還有許多其它藥物處于臨床不同階段研究當(dāng)中[11]。

乳腺癌作為一種嚴(yán)重危害中國(guó)女性健康的惡性腫瘤，患病率和死亡率均居全球女性惡性腫瘤首位。乳腺癌是引發(fā)腦轉(zhuǎn)移的第2位實(shí)體惡性腫瘤，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率占轉(zhuǎn)移性乳腺癌病例的10% ～16%。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌轉(zhuǎn)移灶的治療方法已有很大進(jìn)步，但是腦部轉(zhuǎn)移灶的治療仍然存在很多難以解決的問(wèn)題，這類(lèi)患者的生存期中位數(shù)很短，通常診斷后1年死亡率達(dá)80%。目前缺乏理想的分子標(biāo)志物用于臨床預(yù)測(cè)、診斷、治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[12]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體篩庫(kù)技術(shù)獲得腦轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系特異性結(jié)合多肽BRBP1，通過(guò)體內(nèi)、外試驗(yàn)均證實(shí)該多肽和231- BR細(xì)胞特異性結(jié)合，基于BRBP1肽構(gòu)建的近紅外熒光分子成像探針可實(shí)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌皮下移植瘤模型鼠腫瘤活體近紅外熒光成像，基于BRBP1 肽構(gòu)建BRBP1- TAT- KLA 復(fù)合肽可顯著增強(qiáng)該復(fù)合肽的體內(nèi)抗腫瘤作用，抑制乳腺癌生長(zhǎng)及腦轉(zhuǎn)移灶的形成。本研究中我們利用DNA重組技術(shù)成功表達(dá)了BRBP1- Fc肽體，并用ELISA、細(xì)胞免疫熒光競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BRBP1- Fc肽體仍具有BRBP1的特性，即和231- BR細(xì)胞特異性結(jié)合，為尋找BRBP1的受體以進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能，并擴(kuò)展其在體內(nèi)外的應(yīng)用范圍奠定了良好基礎(chǔ)。

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The expression and characterization of peptibody targeting to human brain metastatic breast cancer cells

YANG Jiao- jiao，ZHANG Ying，SHEN Yu- qing，WANG Jie，F(xiàn)U Bo，ZHANG Jian- qiong

(DepartmentofMicrobiologyandImmunology，MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective：To construct eukaryotic expression vector of pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1 and identify its recombinant protein expression and specific binding with 231- BR cells. Methods：BRBP1 sequence with EcoRⅠ， NcoⅠenzymes was synthesized by gene company and subcloned into pFUSE- hIgG2- Fc2 vector. After the region was sequenced， the plasmid was transfected into 293T cell line. The expression of the recombinant plasmid in 293T cells was proved by Western blotting.The specific binding was observed by enzyme linked immunosorbent assay and immunofluorescence method. Results：BRBP1 had been constructed into expression vector pFUSE- hIgG2- Fc2 successfully. The expression of BRBP1- Fc fusion protein with a molecular weight 37 kDa was detected by Western blotting. The binding specificity with 231- BR cell was also identified. Conclusion：We have successfully constructed the recombinant plasmid (pFUSE- hIgG2- Fc2- BRBP1) which was expressed in 293T cells and had high binding specificity with 231- BR cell．

[Key words]peptibody; eukaryotic expression; breast cancer; brain metastasis

[收稿日期]2015- 12- 25[修回日期] 2016- 01- 31

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371609)

[作者簡(jiǎn)介]楊姣姣(1989-)，女，山西翼城縣人，在讀碩士研究生。E- mail：15805158176@163.com

[通信作者]張建瓊E- mail：zhjq@seu.edu.cn

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.9; R- 33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)03- 0322- 05

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．007

[引文格式] 楊姣姣,張瑩,沈宇清,等.乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系靶向肽體的表達(dá)與特異性鑒定[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,35(3):322- 326.

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