MTHFR基因多態性與非綜合征性唇腭裂的相關性研究

安　樂　焦曉輝　米　娜　郝嫣汝　宋紅權

(哈爾濱醫科大學，哈爾濱150000)

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MTHFR基因多態性與非綜合征性唇腭裂的相關性研究

安樂①焦曉輝①米娜郝嫣汝宋紅權②

(哈爾濱醫科大學，哈爾濱150000)

[摘要]目的：探討5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關性。方法：選取2014年6月至2015年5月在我院治療的NSCLP患者100例(病例組A),其中單純性腭裂(CPO組)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P組)77例；同時選取100名正常兒童(對照組A)、100名生育過NSCLP患兒母親(病例組B)和100名正常出生兒母親(對照組B)，采用聚合酶聯式反應-限制性片段長度多態性基因分型技術檢測各組MTHFR基因C677T突變。結果：病例組A中，CL/P組C、T等位基因頻率為55.84%和44.16%，CPO組分別為54.35%和45.65%，對照組A分別為75.00%和25.00%，CL/P組和CPO組T等位基因頻率明顯高于對照組A，差異有統計學意義(P<0.05)；CT基因型個體患CL/P的風險是CC基因型個體的2.39倍，患CPO的風險是CC基因型個體的2.98倍；TT基因型個體患CL/P的風險是CC基因型個體的6.70倍，患CPO的風險是CC基因型個體的7.33倍；病例組B和對照組B的等位基因頻率和基因型構成情況比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：MTHFR基因C677T突變可能是NSCLP發生的遺傳危險因素之一，但母親MTHFR基因C677T突變可能與子代發生NSCLP無關。

[關鍵詞]MTHFR基因；NSCLP；相關性；等位基因

唇腭裂是人類較為常見的先天性發育畸形之一，臨床上根據胚胎學發育時期的不同致畸機制，往往將非綜合征性唇腭裂分為單純性唇腭裂和唇裂伴或者不伴腭裂。相關臨床統計可見非綜合征性唇腭裂占到了唇腭裂發生的75%左右[1]，但相關病因研究尚無明確進展，迄今位置多數學者認為，唇腭裂的發病主要為環境因素與遺傳因素相互作用的結果[2,3]。相關國外文獻報道認為，孕婦在孕早期葉酸攝入不足會使得胎兒發生非綜合癥型唇腭裂的幾率增加，同時妊娠三個月內服用葉酸拮抗劑如甲氨蝶呤或者苯妥英鈉均會不同程度的增加新生兒非綜合型唇腭裂的發生[4,5]，提示了葉酸缺乏是導致非綜合型唇腭裂的重要原因，本次臨床研究重在分析5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關性，具體研究如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選取2014年6月至2015年5月在我院治療的非綜合征性唇腭裂(NSCLP)患者100例(病例組A)，其中男性58例，女性42例；年齡4個月～18歲，平均(4.71±2.02)歲；其中單純性腭裂(CPO組)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P組)77例，其中雙側CL/P 17例，單側CL/P 60例。排除綜合性唇腭裂或其他系統畸形。病例組B：選取100名生育過NSCLP患兒母親，年齡23～38歲，平均年齡(28.13±4.58)歲，排除惡性腫瘤、心腦血管方面等疾病。對照組A：選取100名正常兒童，其中男性60例，女性40例，年齡2月～17歲，平均年齡(5.02±2.51)歲，排除其他先天性畸形。對照組B：選取100名正常出生兒母親，年齡22～38歲，平均年齡(28.01±5.21)歲，排除惡性腫瘤、心腦血管方面等疾病。此次實驗通過院內醫學倫理委員會的批準，血液標本在研究對象或在其家長的知情同意的前提下獲得。

1.1.2儀器和試劑tapDNA聚合酶購自立陶宛MBI公司，hinfⅠ、MboⅡ限制性內切酶購自立陶宛MBI公司，2700型PCR購自美國ABI公司，APPLIGENE垂直電泳槽、H6-1微型電泳槽購自上海福馬實驗設備有限公司。

1.2實驗方法將收集到的5 ml全血，ACD抗凝，提取基因組DNA，應用primer5.0引物設計軟件設計引物、內切酶，對于兩個位點進行內切，分別應用PCR擴增引物進行限制性內切酶MAV1、DdeⅠ酶切，產物電泳后進行基因分型。為了驗證基因分型正確性，隨機挑選10%的樣本直接測序，同時設立陽性對照炎癥內切酶的正確性。

1.3統計學處理數據分析采用SPSS19.0統計軟件，C677T基因型及等位基因頻率使用χ2檢驗，C677T基因型與NSCLP相關性采用優勢比表示。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1C677T多態性電泳結果DNA片段擴增后長度為198 bp，若發生C→T突變，則產生HinfⅠ酶切位點，產生175 bp和23 bp片段。純和突變型(TT)產生175 bp，23 bp兩個DNA片段，雜合子(CT)產生198、175、23 bp三個DNA片段，野生型(CC)只用198 bp一個DNA片段。以標準分子量Marker為參照，在電泳圖譜上可看到CC基因型、CT基因型和TT基因型，見圖1。

2.2病例組A與對照組A C677T基因型和等位基因頻率比較病例組A中，CL/P組C、T等位基因頻率為55.84%和44.16%，CPO組分別為54.35%和45.65%，對照組A分別為75.00%和25.00%，CL/P組和CPO組T等位基因頻率明顯高于對照組A，差異有統計學意義(χ2=14.367、7.769，P<0.05)；CT基因型個體患CL/P的風險是CC基因型個體的2.39倍，患CPO的風險是CC基因型個體的2.98倍；TT基因型個體患CL/P的風險是CC基因型個體的6.70倍，患CPO的風險是CC基因型個體的7.33倍。見表1。

圖1　MTHFR基因C677T多態性電泳結果Fig.1　MTHFR gene C677T polymorphic electrophor-esis resultsNote: 3-6.CC genotype;1,2,8.CT genotype;7.TT genotype;M.Standard molecular weight Marker.

表1病例組A與對照組A C677T基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.1Case group A and control group A C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupA10032(32.00)54(54.00)14(14.00)118(59.00)82(41.00)CL/Pgroup7723(29.87)40(51.95)14(18.18)86(55.84)68(44.16)CPOgroup236(26.09)13(56.52)4(17.39)25(54.35)21(45.65)ControlgroupA10055(55.00)40(40.00)5(5.00)150(75.00)50(25.00)

表2病例組B與對照組B C677T基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

Tab.2Case group B and control group B C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupsnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupB10043(43.00)47(47.00)10(10.00)133(66.50)67(33.50)ControlgroupB10039(39.00)50(50.00)11(11.00)128(64.00)72(36.00)

2.3病例組B與對照組B中C677T基因型和等位基因頻率比較病例組B的C、T等位基因頻率分別為66.50%和33.50%，對照組B的等位基因頻率分別為64.00%和36.00%，差異比較無統計學意義(χ2=0.276，P>0.05)；兩組基因型構成情況比較差異無統計學意義(χ2=0.336，P>0.05)。見表2。

3討論

近年來隨著先天性唇腭裂相關研究的進展，多數學者認為，先天性基因易感性以及環境因素獨立以及相互作用的方式，均可能較為顯著地參與到了先天性唇腭裂特別是非綜合型唇腭裂的發生中[6]。筆者通過回顧國內外相關文獻發現，基礎領域的研究著重探討了基因水平的變異或者易感基因的先天性獲得對于唇腭裂的發病影響[7]，古麗等[8]研究者證實，在孕婦懷孕早期(一般認為懷孕3月)，葉酸的攝入不足以及葉酸相關拮抗劑的攝入均在一定程度上增加了新生兒唇腭裂的發生率，但相關臨床薈萃分析較少，同時進一步研究并未發現新生兒唇腭裂的發生與葉酸攝入水平存在明顯的劑量依賴性[9]。故此，近三年來部分學者通過研究提出葉酸對于唇腭裂的發生影響并不僅僅依靠葉酸攝入水平，更多依靠相關葉酸代謝途徑，進而促進部分致畸基因的異常激活，從而增加唇腭裂的發生率[10]，而C677T多態性對于先天性唇腭裂的臨床易感性研究較少，本研究重在探討黑龍江省漢族人群中5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T多態性與非綜合征性唇腭裂(NSCLP)遺傳易感性的相關性，進而為相關流行病學統計以及公共衛生領域分析提供依據。

部分學者在探討A1298C多態性與先天性非綜合型唇腭裂的發生關系中發現，C677正常核型均為677CC，當非綜合型唇腭裂易感基因A1298部位核型由A1298AA突變為1298CC時，部分C677核型突變為677TT[11]，提示了C677核型突變可能參與到了非綜合型唇腭裂的發生機制中。筆者通過本次研究發現，野生型C677基因有CC突變為雜合型(CT)或者純核型(TT)，進一步證實了相關學者的提出的假設[12]，表明C677基因多態性可能參與到了非綜合型唇腭裂的發生機制中，而進一步分析可見，單純性唇腭裂以及唇裂伴或者不伴腭裂組T等位基因頻率明顯高于正常對照人群，而相關基因型分析可見隨著C-T基因突變的發生，雜合型突變基因型導致新生兒患非綜合型唇腭裂的幾率增加了2～3倍，而當C-T突變為純突變型基因型時，發生兩種唇腭裂的可能性顯著增加，風險可增加7倍左右，提示了C677基因多態性與非綜合型唇腭裂的發生關系， Desai等[13]綜合分析后認為，MTHFR基因677C-T或1298A-C突變使控制葉酸代謝的MTHFR蛋白構象發生變化，MTHFR酶活性顯著下降，而這一代謝途徑對于維持正常血漿5-甲基四氫葉酸和hcy的濃度至關重要，而hcy與頜面部和神經管在胚胎發育上密切相關，細胞內MTHFR基因677C-T突變導致的MTHFR酶活性顯著下降，可進一步通過促進細胞內Hey聚集，有可能干擾正常發育的頜面部組織，影響頜面部突起的正常融合，進而導致唇腭裂的發生。但相關先天性唇腭裂畸形新生兒產婦的C677基因并無明顯多態性表現，提示母體相關位點基因并未在唇腭裂的發生中發揮作用，同時提示相關唇腭裂新生兒C677位點多態性的獲得性發生機制較為少見，多數病例在胚胎發育過程中由于環境或者其他因素進而造成相關位點突變，引起易感基因多態性表現[11]。

綜上所述，本研究證明了MTHFR基因C677T突變與NSCLP風險增高顯著相關，為葉酸攝入低或葉酸代謝障礙在NSCLP發生中起重要作用的假說提供了遺傳學基礎。后續相關研究應更加注重MTHFR基因C677T多態性與葉酸攝入量之間的交互作用，并對MTHFR酶活性、血漿hcy水平進行綜合分析。

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[收稿2015-09-20修回2015-10-20]

(編輯許四平)

MTHFR gene polymorphism and non syndrome cleft lip and palate correlation study

ANLe，JIAOXiao-Hui,MINa,HAOYan-Ru,SONGHong-Quan.

TheSchoolofDentistryofHarbinMedicalUniversity,Haerbin150000,China

[Abstract]Objective:To investigate 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene C677T polymorphism and non syndrome cleft lip and cleft palate (NSCLP) genetic susceptibility correlation.Methods: From June 2014 to May 2015,100 NSCLP patients (case group A) were treated in our hospital,where in cleft palate (CPO group) 23 cases,77 cases of cleft lip with or without cleft palate (CL/P group);at the same time,selected 100 normal children (control group A),100 mothers of NSCLP children (case group B) and 100 normal birth mother (control group B),C677T mutation of MTHFR gene was detected by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism genotyping technique.Results: in case group A,CL/P group C,T allele frequency were 55.84% and 44.16%,CPO group were 54.35% and 45.65%,control group A was 75.00% and 25.00%,CL/P and CPO group T allele frequency was significantly higher group A,the difference was statistically significant (P<0.05);CT genotypes suffering CL/P′s risk was 2.39 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 2.98 times the CC genotype；TT genotypes suffering CL/P′s risk was 6.70 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 7.33 times the CC genotype;there was no significant difference in the allele frequencies and genotype between the case group B and the control group B (P>0.05).Conclusion: C677T mutation of MTHFR gene may be one of the genetic risk factors of NSCLP,but mother MTHFR C677T mutation may unrelated with the offspring NSCLP.

[Key words]MTHFR gene;NSCLP;Relativity;Allele

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.027

作者簡介：安樂(1988年-)，男，主要從事唇腭裂發生機制研究。

中圖分類號R782.2

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0722-04

①哈爾濱醫科大學第一附屬口腔醫院，哈爾濱150000。

②黑龍江省醫院，哈爾濱150000。

通訊作者及指導教師：焦曉輝(1958年-)，男，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事唇腭裂發生機制研究。