大鼠免疫器官中CD103+CD4+/-樹突狀細胞的分布和形態(tài)學觀察

周福榮　付志強　錢世鹍

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,廣州510260)

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大鼠免疫器官中CD103+CD4+/-樹突狀細胞的分布和形態(tài)學觀察

周福榮付志強錢世鹍

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院,廣州510260)

[摘要]目的：針對樹突狀細胞功能差異，探討CD103+CD4+亞群在大鼠各級免疫器官中的分布與形態(tài)差異。方法：運用雙重免疫組化及免疫熒光雙標記法通過CD103及CD4對樹突狀細胞各亞群進行標記，通過光鏡、熒光倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察樹突狀細胞各亞群的含量、分布和形態(tài)。結果：腸系膜淋巴結中CD103+DC約占其內細胞總數的1.7%,胸腺次之約1.2%,脾臟最少約0.98%。不同部位各亞群DC的形態(tài)也存在一定差異，胸腺及腸系膜淋巴結DC大多數為CD4-CD103+DC且形態(tài)不規(guī)則有較長突起。脾臟CD4-CD103+DC核小而不規(guī)則，突起較細小。結論：大鼠各級免疫器官中各樹突狀細胞亞群存在分布及形體差異，這一差異可能與其在遷移分化過程中在各級免疫發(fā)揮不同調節(jié)功能有關。

[關鍵詞]樹突狀細胞;免疫器官;免疫熒光;免疫組化

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是一類專職的抗原提呈細胞，在機體免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。這群細胞中有些可以誘導機體對異體抗原產生特異性免疫應答；有些可以誘導機體對特異性抗原的免疫耐受。近年研究發(fā)現，樹突狀細胞的功能差異主要是因為在體內樹突狀細胞存在不同亞群[1]。但要確切肯定某一表型與其功能的關系依然受到諸多困擾。首先是因為DC在其發(fā)育成熟過程中存在遷移、表型和形態(tài)變化，其次依照機體各級免疫調節(jié)器官發(fā)揮作用不同也影響了不同DC亞群的分布，再次目前大多實驗在體外進行不能完全反映機體真實情況，亦可能因實驗因素導致表型與形體改變[2，3]。因此，我們希望通過對大鼠生理狀態(tài)下各免疫器官中DC亞群的分布、形體特點的調查，為今后深入研究病理狀態(tài)下各DC亞群表型與功能提供基礎數據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物Sprague-Dawley雄性大鼠20只，6～8周齡，180～200 g/只，購于廣東省實驗動物中心。按SPF級動物飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)，適應環(huán)境1周。實驗前禁食6 h，腹腔注射水合氯醛過量麻醉處死大鼠，立即取胸腺、脾及腸系膜淋巴結放入10%中性福爾馬林溶液中固定備用。

1.1.2主要試劑小鼠抗大鼠CD103單克隆抗體(eBioscience)。兔抗CD4多克隆抗體(Santa Cruse公司)。Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(BD phar mingen)。DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(AppliChem公司)。DouSPTM免疫組化雙染試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)。

1.2方法

1.2.1雙重免疫組織化學將固定、包埋好的組織切成5 μm石蠟切片并貼于防脫玻片上，常規(guī)脫蠟，梯度酒精水化。3%H2O2室溫處理20 min。抗原修復：檸檬酸緩沖液(0.01 mmol/L，pH6.0)微波爐高火5 min，中低火15 min。用PBS沖洗后加入一抗37℃孵育30 min。沖洗后加入生物素化二抗37℃孵育30 min后加入堿性磷酸酶復合物37℃孵育45 min， BCIP/NBT顯色5 min。沖洗后加入第二種一抗37℃孵育30 min。再次加入第二種生物素化二抗37℃孵育30 min后加入過氧化物酶復合物37℃孵育30 min，DAB顯色10 min。染色后用光學顯微鏡觀察計數并拍照。

1.2.2雙標免疫熒光標記同1.2.1方法固定、包埋、脫蠟、水化制成5 μm石蠟切片。正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min，抗原修復方法同1.2.1。吸去血清加入一抗混合液(CD103、CD4稀釋度分別為1∶50、1∶200)濕盒內4℃過夜。沖洗后加入二抗Alexa Fluor 594 羊抗小鼠 IgG(1∶200)37℃避光孵育30 min，再次沖洗后加入二抗Alexa Fluor 488羊抗兔 IgG、(1∶200)37℃避光孵育30 min，DAPI(1 μg/ml)室溫避光孵育15 min，滴加抗熒光衰減封片劑封片。分別在熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下計數及進行形態(tài)學觀察并拍照。

1.2.3樹突狀細胞各亞群計數及統(tǒng)計學處理每張切片取10個高倍視野，CD103+DC及CD4+/-DC亞群的含量=免疫組織化學(或免疫熒光)標記陽性細胞數/該視野內細胞總數×100%。

2結果

2.1各免疫器官中樹突狀細胞亞群的分布胸腺中CD103+DC約占胸腺細胞總數的1.2%，脾臟中CD103+DC約占脾臟細胞總數的0.98%，腸系膜淋巴結中CD103+DC約占腸系膜淋巴結細胞總數的1.7%。表1、2分別用免疫組化法和免疫熒法檢測的CD4+CD103+DC和CD4-CD103+DC在各免疫器官中占細胞總數百分比。免疫組化和免疫熒光檢測結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各免疫器官中樹突狀細胞的形態(tài) 胸腺DC(Thymus DC，TDC)主要分布在胸腺皮髓交界處及髓質。CD4+CD103+DC細胞較規(guī)則，突起小且細，核大而圓；CD4-CD103+DC細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有較長突起(見圖1)。脾臟DC(Spleen DC，SDC)分布較分散無明顯集聚區(qū)，白髓和紅髓內均可見散在DC，CD4+CD103+DC異源性大，細胞大而不規(guī)則，核相對較小，突起較細小；CD4+CD103+DC中等大小，核漿比高，核規(guī)則(見圖2)。腸系膜淋巴結(Mesenteric lymph nodes，MLN)內DC主要分布于副皮質區(qū)和淋巴濾泡內，樹突狀細胞兩亞群CD4+CD103+DC核小而不規(guī)則，細胞質較多，突起細小。CD4-CD103+DC核大而圓，胞漿少，突起較長(見圖3)。

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.500.32±0.088.00±2.300.75±0.07S7.00±1.600.43±0.047.00±1.800.41±0.06MLN3.00±1.000.24±0.0827.00±5.401.59±0.06

Note：T.The thymus；S.The spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes；1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

CD103+CD4+DC1)CD103+CD4+DC(%)2)CD103+CD4-DC1)CD103+CD4-DC(%)2)T5.00±1.400.33±0.0613.00±3.100.87±0.06S7.00±1.900.35±0.087.00±2.000.38±0.02MLN3.00±1.300.19±0.0722.00±4.601.33±0.47

Note：T.The thymus;S.Spleen；MLN.Mesenteric lymph nodes;1)show the number of DC subsets in tissue sections at per high power lens;2)show the percentage of DC subsets in tissue sections at per high power lens.

圖1　大鼠胸腺CD103+CD4+/-樹突狀細胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.1　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat thymus by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos(×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

圖2　大鼠脾臟CD103+CD4+/-樹突狀細胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.2　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat spleen by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Spleen immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Spleen immunofluorescence images(×400):the green arrow for CD103+ ,the bright red arrow for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Spleen laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

圖3　大鼠腸系膜淋巴結CD103+CD4+/-樹突狀細胞形態(tài)的免疫組化和免疫熒光分析Fig.3　Detecting morphology of CD103+CD4+/-dendritic cells in rat MLNs by immunohistochemistry and fluroresence immunohistochemistryNote: A.Thymus immunohistochemistry photos (×400):brown arrow for CD103+,blue arrow for CD4+;B.Thymus immunofluorescence images(×400):the green for CD103+ ,the bright red for CD4+，yellow arrow for CD103+ and CD4+ ;C.Thymus laser confocal images(×630):red arrow for CD103+ CD4-DC,yellow arrow for CD103+ CD4+ DC.

3討論

樹突狀細胞是一個異質性群體，大量的研究表明這種異質性主要與其在體內存在不同的亞群有關。在對大鼠樹突狀細胞的研究中，CD103是公認的標記大鼠DC的標記方法[1,2]。在體外實驗發(fā)現CD103+DC根據是否表達CD4表面抗原可以分成兩個功能和形體各異的兩種DC亞群[4-6]。在本次實驗中我們通過CD103、CD4對胸腺、脾及腸系膜淋巴結組織切片中DC進行標記，對體內生理狀態(tài)下的DC兩亞群的分布及形體學進行直接觀察。本實驗避免了體外實驗對DC亞群分布及形體的干擾，使結果更接近DC在體內的真實情況。

該實驗通過對免疫組化免疫熒光標記結果進行統(tǒng)計學計數分析我們發(fā)現不同免疫器官中CD103+DC的分布不均,腸系膜淋巴結中含量最為豐富約占其內細胞總數的1.7%,胸腺次之約1.2%,脾臟最少約0.98%且腸系膜淋巴結DC和胸腺DC均以CD4-CD103+DC為主分布，分別占細胞總數的1.33%和0.86%，這種差異可能與其在免疫調節(jié)過程中行使的功能有關，研究發(fā)現胸腺作為免疫調節(jié)的中樞器官在中樞耐受中發(fā)揮著主要作用，并且腸系膜淋巴結在口服耐受和自身耐受中發(fā)揮著主要作用[7]。這可能導致這些器官中某種調節(jié)免疫耐受的DC亞群含量相對占優(yōu)勢，我們認為這種存在于胸腺和腸系膜淋巴結中的DC亞群可能是CD103+CD4-DC。而對于脾臟來說，其主要參與機體的免疫應答，因此表現出CD4-DC的含量相對較少。另外，這種差異還可能與其起源有關在對小鼠胸腺基質細胞的研究中發(fā)現,胸腺中約50%的DC是由外周DC遷移而來的,這些DC包括CD11b+CD8-cDCs[8]。在大鼠中與CD11b+CD8-cDCs功能相近的DC亞群為CD4+CD103+DCs,可能在大鼠中的CD4+CD103+DCs也是遷移性的DC,導致其在胸腺中含量較少，本實驗所得的CD4+CD103+MLN DC及CD4-CD103+MLN DC的相對含量分別為0.19%±0.07%和1.33%±0.47%;與Turnbull等[9]通過免疫磁珠對腸系膜淋巴結各DC亞群分選結果CD4+CD103+DC在腸系膜淋巴結中很少,大多數為CD4-CD103+DC的描述相近,但他們并未給出確切的數據Cecile Voisine等[5]將新提取的脾臟經過做成細胞懸液并運用免疫磁珠篩選發(fā)現脾臟中CD103+DC的CD4+/-兩亞群所含比例相近,我們在對脾臟中DC亞群的含量研究發(fā)現CD4+CD103+DC約占脾臟內細胞總數的0.35%，CD4-CD103+DC含量約為0.38%,結果相似。此外，不同免疫器官中DC的形態(tài)也不盡相同。胸腺CD4+CD103+DC及脾臟CD4+CD103+DC細胞較規(guī)則，核漿比高，核規(guī)則，但脾臟DC形態(tài)較小；腸系膜淋巴結CD4+CD103+DC核小而不規(guī)則，核漿比小，有細小的樹突。胸腺及腸系膜淋巴結CD4-CD103+DC細胞形態(tài)不規(guī)則，核漿比大，均有較長突起；而脾CD4-CD103+DC核漿比相對較小，突起較細小。我們認為這種形態(tài)學上的差異可能是因為胸腺和腸系膜淋巴結由于要對各種不同的抗原保持一定強度的耐受處于相對較為活躍的狀態(tài)，所以樹突較粗且長;而對于脾臟主要是在機體受到病原微生物入侵等情況時功能才會活躍起來，在穩(wěn)態(tài)下，這一產生特異性免疫應答的功能并未表現出來，以致于其內的樹突狀細胞也表現為一種未激活的狀態(tài)，細胞顯得小而樹突少。

本次實驗研究對CD4+/-CD103+DC在大鼠各級免疫調節(jié)器官中的分布情況有了較為全面的了解，這在以前的研究中是未有的，本研究的結果將有助于我們在病理狀態(tài)下進一步探究各級免疫器官如何調整CD4+/-CD103+DC亞群進行免疫調節(jié)。

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[收稿2015-08-07修回2015-08-28]

(編輯張曉舟)

Observation of distribution and morphology of rat CD103+CD4+/-dendritic cells in immune organs

ZHOUFu-Rong,FUZhi-Qiang,QIANShi-Kun.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，China

[Abstract]Objective:For the functional differences in dendritic cell subsets,the study gains insight into the distributional and morphological differences of rat dendritic cells in immune organs.Methods: Immunohistochemical staining and Immunofluorescent staining were perfomed to study the morphology and the distribution of rat dendritic cells by DC marker(including CD103 and CD4).Results: In Mesenteric lymph nodes CD103+ DC accounted for about 1.7% of its total number of mononuclear cells,followed by about 1.2% in the thymus and least in spleen about 0.98%.There were certain differences among DC in different immune organs.The majority of TDCs were CD4-CD103+DC,the morphology of CD4-CD103+T DCs and MLN DCs was irregular and long dendrites could be observed .In MLN most of CD4-CD103+DCs contain a large,round nucleus and with relatively long dendrites.The nuclei of CD4-CD103+DCs were small and irregular while their dendrites was smaller.Conclusion: That the distribution and morphology of the subsets of dendritic cells in different immune organs being not identical may be related to the subsets of dendritic cells playing different regulatory functions in the process of migration and differentiation in immune organs.

[Key words]Dendritic cell；Immune organ；Immunofluorescence；Immunohistochemistry

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.012

作者簡介：周福榮(1987年-),男,在讀碩士,主要從事肝癌外科及腫瘤生物學治療研究，E-mail：1010047185@qq.com。通訊作者及指導教師：錢世鹍(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事肝癌外科及腫瘤生物學治療研究，E-mail：qiansk@qq.com。

中圖分類號R392.12

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0656-04