類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子微球?qū)Τ晒羌?xì)胞功能的影響

張思慧， 陳小玲， 趙　欣

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓二科，福州　350002

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類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子微球?qū)Τ晒羌?xì)胞功能的影響

張思慧， 陳小玲， 趙欣

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓二科，福州350002

摘要:目的研究不同濃度類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(IGF-1)微球?qū)Τ晒羌?xì)胞功能的影響。方法緩釋微球制作采用乳化冷凝聚合交聯(lián)法；根據(jù)微球的藥代動(dòng)力學(xué)特性，將載不同濃度的IGF-1明膠微球分為0.25,2.5,25,250 ng/mg組及空白對(duì)照組，通過細(xì)胞增殖和分化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同濃度IGF-1微球?qū)Τ晒羌?xì)胞功能的影響。結(jié)果載不同濃度IGF-1的微球?qū)?xì)胞增殖的影響有顯著性差異，0.25,2.5,25 ng/mg組對(duì)成骨細(xì)胞均具有顯著的促增殖作用，其中25 ng/mg組的促增殖作用最為顯著。載不同濃度IGF-1的微球?qū)?xì)胞分化的影響有顯著性差異，其中25 ng/mg組的促分化作用最為顯著。結(jié)論IGF-1明膠微球有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用，其最佳濃度為25 ng/mg。

關(guān)鍵詞:受體，類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子； 明膠； 微球體； 成骨細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞分化

類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor 1, IGF-1)是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽蛋白物質(zhì)，主要由成骨細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成和成骨細(xì)胞分化以及保護(hù)骨基質(zhì)的作用[1-2]。IGF-1可明顯提高生物材料的生物活性，促進(jìn)有絲分裂，刺激成骨細(xì)胞的增殖及膠原合成，促進(jìn)骨折的愈合，且有時(shí)間和劑量依賴性[3-5]。有研究報(bào)道，IGF-1在0.1～10 ng/mL范圍內(nèi)，隨著濃度增加，刺激成骨細(xì)胞的增殖作用逐漸增強(qiáng)，而濃度為10～100 ng/mL時(shí)，則無(wú)明顯促增殖作用[6-8]。然而，各研究報(bào)道中IGF-1的濃度差異較大，且因IGF-1在體內(nèi)很快擴(kuò)散，易被蛋白酶分解，半衰期短等原因，目前尚未實(shí)現(xiàn)IGF-1的臨床應(yīng)用。為更好地利用IGF-1，保護(hù)生長(zhǎng)因子活性，延長(zhǎng)其作用時(shí)間，本研究采用乳化冷凝聚合交聯(lián)法制作不同濃度的IGF-1緩釋微球，用于促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖，明確IGF-1的最佳濃度，討論載IGF-1緩釋系統(tǒng)對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1材料人成骨肉瘤成骨細(xì)胞MG63細(xì)胞(中南大學(xué)細(xì)胞中心)，明膠(美國(guó)Sigma公司)，IGF-1凍干粉劑(美國(guó)PeproTech公司)；酶標(biāo)儀(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)，激光衍射粒度分析儀(Mastersizer 2000型，英國(guó)馬爾文公司)。

1.2方法

1.2.1IGF-1明膠微球的制備采用乳化冷凝聚合交聯(lián)法制備的明膠微球粒徑為10～40 μm，占80.25%，平均粒徑為(20.33±3.67)μm，微球24 h內(nèi)釋藥達(dá)到20%，隨后速度減慢。將5 μL的5，50，500，5 000 ng/mL的IGF-1溶液加入1 mg干燥微球，即IGF-1明膠微球濃度為0.25，2.5，25，250 ng/mg。微球保存在pH為7.4的IGF-1溶液中，溫度4 ℃，持續(xù)24 h，1 200～1 500 r/min速度下離心15 min，經(jīng)雙蒸水洗滌后利用冷凍干燥機(jī)凍干，經(jīng)鈷-60滅菌后保存。

1.2.2IGF-1微球的釋藥速率體外實(shí)驗(yàn)隨機(jī)取0.25，2.5，25，250 ng/mg的IGF-1明膠微球2 mg，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，注入RPMI-1640培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取搖勻浸提液，EP管中存放，4 ℃保存。每孔再加入2 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，以同樣方法留取2，4，6，8，10，12 d的浸提液，同法保存。按照ELISA法檢測(cè)IGF-1釋放速率，用酶聯(lián)免疫儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定上述保存液的OD值，與IGF-1標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算出上述樣本的IGF-1濃度，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)釋放液的IGF-1含量分別加上前一時(shí)間點(diǎn)的IGF-1釋放總量，得出該時(shí)間點(diǎn)的IGF-1釋放總量，繪制IGF-1釋放曲線。

1.2.3明確IGF-1微球有效濃度的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞利用0.25%胰酶消化，配制MG63懸液(5×104mL-1)，利用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于無(wú)菌24孔板內(nèi)。24 h后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁且平鋪于培養(yǎng)板內(nèi)時(shí)，加入無(wú)菌IGF-1微球2 mg，分為5組：0.25，2.5，25，250 ng/mg組及空白對(duì)照組，每個(gè)樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)為1，3，7，12 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均采用同樣方法接種24孔培養(yǎng)板，輕吸上層培養(yǎng)液，置于無(wú)菌EP管中，4 ℃下保存。

1.2.3.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)PBS緩沖液清洗每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的24孔培養(yǎng)板3次，滴入5 mg/mL的四唑鹽(MTT)，每孔150 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取培養(yǎng)板，加三聯(lián)液(10%十二烷基硫代硫酸鈉+5%異丁醇+12 mmol/L鹽酸) 600 μL于24孔中，5 min后轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm下的OD值。

1.2.3.3細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品按說明書稀釋，各孔加樣量均為50 μL，取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)菌EP管中的培養(yǎng)液，設(shè)空缺孔(不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)及待測(cè)培養(yǎng)液孔。待測(cè)培養(yǎng)液孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min，洗滌后加酶，顯色，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min后終止。空缺孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD值。

2結(jié)果

2.1微球制作制備的IGF-1明膠緩釋微球具有良好的分散性。掃描電鏡下可見制備的明膠微球?yàn)楸砻婀饣⒘骄鶆虻膱A球(圖1，2)。

2.2載不同濃度IGF-1明膠微球藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)載不同濃度IGF-1明膠微球初釋速度較快，24 h內(nèi)達(dá)到20%～30%左右，具有突釋效應(yīng)，3 d時(shí)IGF-1釋放量約達(dá)40%，速度隨時(shí)間增加而減緩，12 d時(shí)IGF-1累計(jì)釋放率約為93%(圖3)。

2.3測(cè)定IGF-1明膠微球有效濃度

2.3.1MG63細(xì)胞數(shù)量及形貌觀察倒置顯微鏡下，細(xì)胞培養(yǎng)1 d后開始貼壁，觸角未完全展開；3 d后各孔細(xì)胞貼壁完全，細(xì)胞數(shù)量較1 d時(shí)有所增加，形態(tài)呈多邊形，觸角伸展良好，各孔內(nèi)差別不明顯(圖4)。

2.3.2不同濃度IGF-1明膠微球?qū)G63細(xì)胞增殖的影響MG63和不同濃度IGF-1明膠微球體外培養(yǎng)1，3，7，12 d后，通過MTT檢測(cè)MG63細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，不同濃度組在1，3，7，12 d時(shí)，組間比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中25 ng/mg組的細(xì)胞增殖結(jié)果最高，250 ng/mg組的細(xì)胞增殖結(jié)果最低(表1，圖5A)。

2.3.3不同濃度IGF-1明膠微球?qū)G63細(xì)胞分化的影響不同濃度IGF-1明膠微球與MG63細(xì)胞體外培養(yǎng)1，3，7，12 d后，通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞分化功能,結(jié)果顯示，不同濃度組間和不同時(shí)間點(diǎn)間的比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中25 ng/mg組的細(xì)胞分化結(jié)果最高，0 ng/mg組的細(xì)胞分化結(jié)果最低(表1，圖5B)。

3討論

本研究采用明膠微球作為IGF-1可控緩釋系統(tǒng)，明膠是含有生物活性短肽的天然高分子生物材料，且生物相容性好。在明膠微球利用冷凍干燥機(jī)凍干過程中，與多肽形成氫鍵，形成穩(wěn)定的多肽，利于細(xì)胞表面分子識(shí)別，具有保護(hù)IGF-1活性等優(yōu)點(diǎn)[9]。丁紅等制備阿奇霉素明膠微球，采用乳化化學(xué)交聯(lián)法，對(duì)其分布及粒徑、體外釋放速率進(jìn)行研究，證明明膠微球具有良好的可控緩釋性能[10]。故本實(shí)驗(yàn)選擇明膠微球作為可控緩釋載體。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1微球24 h內(nèi)釋藥率達(dá)20%，隨后速度減慢[11]。本研究顯示，3 d后微球釋藥率約40%。

3.1IGF-1微球濃度分組IGF-1的有效應(yīng)用濃度和對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化的作用目前尚不明確[12-13]。一般認(rèn)為，IGF-1呈劑量、時(shí)間依賴性增強(qiáng)骨源性間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨分化，一定濃度范圍內(nèi)的IGF-1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度的IGF-1對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用，甚至可能對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用[14]。有研究報(bào)道，IGF-1在0.1～10 ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，隨著濃度的增加，可刺激成骨細(xì)胞的增殖；濃度為10～100 ng/mL時(shí)，則無(wú)明顯促增殖作用。研究報(bào)道中,IGF-1濃度差異較大，本研究中，3 d微球釋藥率約40%，為維持IGF-1有效濃度在0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)，本研究將5 μL的5，50，500，5 000 ng/mL的IGF-1溶液加入1 mg干燥微球[10-11]，即IGF-1明膠微球濃度分別為0.25，2.5，25，250 ng/mg。

IGF-1：類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子.與0 ng/mg組比較，☆：P<0.05；與0.25 ng/mg組比較，Δ：P<0.05；與2.5 ng/mg組比較，▲：P<0.05；與25 ng/mg組比較，●：P<0.05.

3.2不同濃度IGF-1明膠微球?qū)G63細(xì)胞增殖的影響2.5～25 ng/mg的IGF-1明膠微球均可促進(jìn)MG63細(xì)胞增殖，且呈劑量正效應(yīng)關(guān)系，25 ng/mg濃度時(shí)促增殖分化作用最強(qiáng)。分析原因：IGF-1與骨骼IGF-1受體結(jié)合使胰島素受體底物磷酸化，激活PI3K依賴的AKT，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和存活。但是,細(xì)胞膜表面Fas表達(dá)也同時(shí)增加，而Fas介導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，即IGF-1可同時(shí)調(diào)節(jié)成骨破骨過程，進(jìn)而影響骨改建和骨形成。250 ng/mg的IGF-1在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，有可能加劇破骨細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致增殖作用受到抑制[15-16]。

3.3不同濃度IGF-1明膠微球?qū)G63細(xì)胞分化的影響IGF-1促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)可抑制其凋亡，并使其早期就進(jìn)入分化階段，250 ng/mg IGF-1的明膠微球?qū)G63細(xì)胞ALP活性的影響與它對(duì)細(xì)胞增殖的作用恰恰相反，提示成骨細(xì)胞增殖和分化過程可能是兩個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的過程，這對(duì)于骨組織修復(fù)和骨形成意義重大[17]。本研究結(jié)果與許多報(bào)道并未完全一致，原因可能是各實(shí)驗(yàn)中所使用的IGF-1濃度、MG63細(xì)胞來源和細(xì)胞密度不同。

本研究結(jié)果提示，載有2.5～25 ng/mg IGF-1的明膠微球能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，且呈濃度依賴，最佳濃度為25 ng/mg，但其在臨床上的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

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(編輯：何佳鳳)

The Effects of Gelatine Microspheres Loading with Different Concentrations of IGF-1 on the Function of Osteoblast Cells

ZHANG Sihui, CHEN Xiaoling, ZHAO Xin

Department II of Endodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China

ABSTRACT:ObjectiveTo evaluate the effects of gelatin microspheres loaded with different concentrations of IGF-1 on the function of osteoblast cells in vitro.MethodsThe improved emulsified cold condensation method was employed to fabricate the gelatin microspheres loaded with following five concentration groups of IGF-1: 0.25, 2.5, 25, 250, 0 (negative control) ng/mg.The effects of loaded gelatin microspheres on proliferation and differentiation of MG63 were then checked in vitro.ResultSignificant different effects of gelatin microspheres loaded with different concentrations of IGF-1 on osteoblast cells’ proliferation were evident.The proliferation amount of the cells was in the following order: group 25 ng/mg>group 2.5 ng/mg>group 0.25 ng/mg>group 0 ng/mg>group 250 ng/mg(P<0.05).Similarly, significant different effects on osteoblast cells’ differentiation were found in the following fashion: alkaline phosphatase(ALP) in group 25 ng/mg>groups 2.5, 250 and 0.25 ng/mg>group 0 ng/mg(P<0.05).ConclusionGelatin microspheres loading with IGF-1 had positive effects on the function of osteoblast cells.The preferred concentration of IGF-1 on the gelatin microspheres is 25 ng/mg.

KEY WORDS:receptor, IGF type 1; gelatin; microspheres; osteoblasts; cell proliferation; cell differentiation

收稿日期:2015-08-31

基金項(xiàng)目:福建省教育廳B類項(xiàng)目(JB12128)

作者簡(jiǎn)介:張思慧(1983-)，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士. Email: zshfmu@sina.com

中圖分類號(hào):R329.24； R94； R963； R977.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-4194(2016)01-0015-05