1例疑似急變的CML患者的實驗診斷

馬　強，劉青松，蔡　燕，何　城，梁　騎，劉　馨，王　靜，張國元，郭曉蘭*

(1.川北醫學院附屬醫院 檢驗科；2.川北醫學院 轉化醫學研究中心；3.川北醫學院附屬醫院 病理科；4.川北醫學院附屬醫院 血液科，四川 南充637000)

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*通訊作者

1例疑似急變的CML患者的實驗診斷

馬強1,2，劉青松1，蔡燕1,2，何城1，梁騎1，劉馨3，王靜4，張國元1,2，郭曉蘭1,2*

(1.川北醫學院附屬醫院 檢驗科；2.川北醫學院 轉化醫學研究中心；3.川北醫學院附屬醫院 病理科；4.川北醫學院附屬醫院 血液科，四川 南充637000)

慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一組起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，疾病過程包括慢性期、加速期和急變期。處于慢性期的病人經過數月或數年之后可發生急變，此時惡性造血干細胞極度增生，可引起不明原因的發熱，脾進一步增大，出現骨痛、出血以及髓外腫物等浸潤現象，如皮膚組織腫塊，淋巴結腫大等。本例研究對象為男性，38歲，5年前診斷為“慢性粒細胞白血病”，給予干擾素、羥基脲等治療后白細胞逐漸降至正常，臨床癥狀好轉出院。近1月，患者自述服藥不規律，間斷服藥，并曾停藥近1周，后出現頭部脹痛，并逐漸累及眶周，伴眼花，眩暈感，10余天前檢查發現白血病再次升高(WBC 100+×109/L)，繼續口服甲磺酸伊馬替尼輔以布洛芬治療5天，白細胞為75.7×109/L，以“慢性粒細胞白血病”入院。體格檢查未發現脾進行性增大，血常規未發現血小板進行性增高或降低，但患者左上肢及雙下肢存在多個棕色疣狀突起物，故依然存在急變可能，遂做以下研究。

1材料與方法

1.1標本

1.1.1骨髓患者取左側屈膝臥位，以右側髂后上脊為穿刺點，常規消毒鋪巾，2%利多卡因逐層麻醉后，持穿刺針旋轉進針獲落空感，拔出針芯，抽取骨髓大約 5 ml。其中0.2 ml用于骨髓細胞形態學檢驗，3 ml用于染色體核型分析，1 ml用于檢測BCR-ABL融合基因，另外1 ml用于檢測SRY基因。另外收集正常男性和女性的外周血各1 ml。

1.1.2皮膚結節患者取平臥位，常規消毒鋪巾，以2%利多卡因在大腿內側皮膚結節處作局部浸潤麻醉，麻醉滿意后在皮膚結節周圍做梭形切口，切除皮膚及皮下組織，止血滿意，縫合切口，組織送病理活檢。

1.2方法

1.2.1骨髓細胞形態學分析抽取0.2 ml骨髓，立即涂片于2張潔凈的載玻片上，自然干燥。一張涂片瑞氏染色后，在普通光學顯微鏡下連續分類計數300個細胞，分別計算各系統各階段細胞的百分率。另外一張進行NAP染色，計算NAP陽性率和NAP積分。

1.2.2骨髓細胞染色體核型分析抽取3 ml骨髓，肝素抗凝，計數后按2×106/L接種于骨髓培養基，培養24 h后，收獲細胞，低滲，滴片，顯帶，吉姆薩染色，按照《人類細胞遺傳學命名的國際體制》(2009版)標準對該患者的染色體核型進行分析。

1.2.3骨髓BCR-ABL融合基因檢測及ABL激酶區突變位點篩查 提取骨髓細胞RNA，送四川金域醫學檢驗中心做BCR-ABL融合基因檢測和ABL激酶區突變位點篩查。

1.2.4SRY基因檢測采用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照說明書步驟提取患者骨髓細胞、一例正常男性和一例正常女性外周血DNA，分別做SRY基因檢測。SRY基因擴增引物[1]：Forward：5′-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3′，Reverse:5′-GTTACCCGATTGTCCTACAGCT-3′，目標片段677 bp。擴增反應體系為：2×master mix 12.5 μl,Forward primer 0.5 μl,Reverse primer 0.5 μl,ddH2O 10.5 μl,DNA template 1 μl。擴增反應條件：95℃ 10 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，35個循環；72℃ 10 min。產物在1%瓊脂糖凝膠中，恒壓160伏電泳20 min后，于凝膠成像儀中拍照。

1.2.5皮膚疣狀突起物活檢皮膚疣狀突起物組織石蠟切片后，嚴格按照HE染色的步驟制片，在普通光學顯微鏡下對該患者組織進行形態學分析。

2結果

2.1骨髓細胞形態學

骨髓涂片細胞形態學提示，粒：紅=31.3，原始粒細胞占3.4%，早幼粒細胞占4.2%，中性中幼粒細胞占17.7%，中性晚幼粒細胞占18.5%，中性桿狀核粒細胞占12.6%，中性分葉核粒細胞占15.1%，嗜酸性分葉核粒細胞占4.2%，嗜酸性分葉核粒細胞占3.4%，中幼紅細胞占1.7%，晚幼紅細胞占0.8%，成熟漿細胞占0.8%；NAP陽性率為4%，NAP積分為4分，骨髓細胞形態學特點符合慢性粒細胞白血病的特征(圖1)。

2.2骨髓細胞染色體核型

按照ISCN2009的標準，分析20個中期分裂相，所見核型均為47，X，-Y ，+8，t(9:22)(q34；q11)，+der(22)t(9；22)[20](圖2)。

圖1　患者骨髓細胞形態學(瑞氏染色，10×100倍)

圖2　患者骨髓細胞染色體核型

2.3骨髓細胞BCR-ABL融合基因檢測ABL激酶區突變位點篩查

四川金域醫學檢驗中心檢測BCR-ABL融合基因結果提示，BCR-ABL融合基因P210型陽性(熒光定量PCR法)，并且ABL激酶區未發現突變位點(直接測序法)。

2.4骨髓細胞SRY基因檢測

骨髓細胞SRY基因檢測結果顯示，患者骨髓細胞與正常男性SRY基因擴增產物在677bp處可見一條均一的條帶，而女性對照和陰性對照無此條帶，故該患者骨髓細胞SRY基因陽性(圖3)。

2.5皮膚結節病理檢查

HE染色后病理檢驗結果提示，左上肢及雙下肢疣狀突起物為纖維瘤(圖4)。

3討論

CML是迄今發現的第一例與染色體異常直接相關的惡性腫瘤，90%左右的患者存在由9號和22號染色體長臂相互易位而產生的特征性Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因[2]。BCR-ABL編碼的P210蛋白具有酪氨酸激酶活性，其使信號通路異常激活，MYC和BCL2轉錄增加，使造血干細胞增殖失控，凋亡受阻，細胞發生惡性轉化。Ph染色體或BCR-ABL融合基因是CML患者重要的診斷、治療和預后標志。

圖3患者SRY基因檢測

圖4　患者皮膚結節病理切片(HE染色，10×40倍)

CML慢性期可以持續的時間相對較長，病情相對穩定；而急變期病情兇險，預后較差。本例患者左上肢及雙下肢出現棕色疣狀突起物，形似綠色瘤，但病理活檢提示為纖維瘤。同時，未發現血小板進行性增高或降低，也未發現脾進行性增大，故目前排除慢粒急變，該患者依然處于CML慢性期。實驗室檢查發現，該患者BCR-ABL融合基因陽性，并且ABL激酶區未發現突變位點，故目前該患者治療上甲磺酸伊馬替有效，故繼續甲磺酸伊馬替尼控制白血病數量，堿化尿液，抑制尿酸生成等治療。

骨髓染色體核型分析提示患者存在-Y、+8和+Ph染色體等額外的染色體異常。CML慢性期出現額外染色體異常約為7%，而在加速期或急變期可達到40%-70%[3,4]，故CML出現額外染色體異常時常常提示疾病可能進展[5]。+8是CML、急性粒細胞白血病、骨髓異常增生綜合征、急性淋巴細胞白血病等疾病中最常見的數目異常，其中以CML患者出現+8的頻率最高[6]，并且+8也是CML患者最主要的額外染色體異常，經常伴有其他額外染色體，比如+Ph[7]。+8，+Ph，+19，i(17q)等是CML加速期或者急變期最典型的染色體畸變，經常先于臨床急變期2-4個月，并且預后較差[8-10]。

此外，-Y也是CML患者一種額外的染色體異常，研究發現，3.6%左右的CML患者可以檢測出骨髓細胞Y染色體的丟失[7]。本例患者骨髓細胞染色體核型分析提示Y染色體的丟失，但是PCR結果提示SRY基因陽性，一方面骨髓中部分腫瘤細胞可能存在Y染色體，因為染色體核型僅僅分析了20個中期分裂相，檢測能力有限；另一方面可能是骨髓中也存在部分正常細胞，雖然粒系增生明顯活躍(?！眉t=31.3∶1)，而紅系、淋巴系增生受抑，但依然可能產生正常的紅細胞和淋巴細胞，SRY基因也可呈陽性。

綜上所述，雖然臨床表現和骨髓形態學均提示該患者目前處于CML慢性期，但是骨髓染色體核型分析發現存在額外的染色體異常，特別是雙Ph染色體，因為染色體異?？梢韵扔谂R床表現數月，故該患者在堅持目前的治療外，應盡早進行骨髓移植，同時應該定期復查血常規、骨髓細胞形態學以及染色體核型，以便及時發現CML急變并采取相應的治療措施，從而延長患者的生存期，改善患者的生活質量。

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1泳道：CML患者；2泳道：正常男性對照；3泳道：女性對照；4泳道：陰性對照2.5 皮膚結節病理檢查

文章編號：1007-4287(2016)05-0843-03

作者簡介：馬強(1987-)，男，檢驗師，碩士研究生，研究方向：腫瘤的分子遺傳學基礎；郭曉蘭，博士，教授，碩士研究生導師，研究方向為腫瘤的信號轉導通路。

(收稿日期：2014-10-17)