PRKCI基因在急性心肌梗死患者外周血白細胞中低表達及其臨床意義

范　琳，孟赫禹，孟繁波*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.延邊大學臨床醫學院)

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*通訊作者

PRKCI基因在急性心肌梗死患者外周血白細胞中低表達及其臨床意義

范琳1，孟赫禹2，孟繁波1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.延邊大學臨床醫學院)

心肌梗死的發病率越來越高，且有年輕化的趨勢。全基因組關聯研究發現，基因的堿基突變可能是導致急性心肌梗死發生的原因之一[1-5]。課題組基因芯片研究發現，有559個基因在急性心肌梗死患者中的表達發生改變[6]。其中，PRKCI基因為顯著低表達，P=0.003517699，LogFC=-1.563554087。本研究擬在RNA水平及蛋白水平研究PRKCI基因在中國東北漢族急性心肌梗死患者中的表達，并對該基因的功能進行分析。

1對象與方法

1.1研究對象

隨機選取2014年11月-2015年1月于吉林大學中日聯誼醫院心血管內科住院治療的20例急性心肌梗死患者為實驗組，20例健康者為對照組，并對其病史、合并癥、生化檢查等相關臨床資料進行詳細記錄及分析。急性心肌梗死的診斷不但要符合美國心臟病協會及美國心臟病學基金會于2012年公布的診斷條件[7]，同時要經過冠狀動脈造影術以進一步證實有明確的血管病變。符合診斷指南并存在血管嚴重狹窄或閉塞的為實驗組，不符合診斷指南且血管狹窄<50%的為對照組。

1.2研究方法

1.2.1外周血淋巴細胞獲取抽取各研究對象晨起空腹外周血6 ml于EDTA抗凝管中，于4℃保存，并在樣本采集4 h內進行淋巴細胞提取，所用試劑為人外周血淋巴細胞分離液。在提取外周血淋巴細胞時，每位研究對象外周血標本分為2部分，一部分4 ml用于提取總RNA，另一部分2 ml用于提取淋巴細胞內總蛋白。詳細步驟如下：1)取新鮮抗凝血與等體積0.9%氯化鈉注射液混勻；2)將上訴混合液小心加至等體積人外周血淋巴細胞分離液上，3 000 r/min離心20 min；3)離心后由上至下分4層，分別為血漿層、乳白色淋巴細胞層、透明分離液層、紅細胞層。將淋巴細胞層吸出用于后續試驗。

1.2.2外周血淋巴細胞cDNA合成①利用血液總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，對所得淋巴細胞進行總RNA提取。提取過程中嚴格按照試劑盒說明書進行，以免RNA受到降解或污染。得到RNA溶液后利用瓊脂糖電泳對RNA的質量進行檢測。符合標準的樣本利用分光光度計測定濃度，濃度符合反轉錄試劑盒要求后再進行反轉錄；②依據反轉錄試劑盒(TOYOBO，上海)說明書對符合實驗要求的總RNA進行反轉錄，每個樣品所加RNA量保持一致。得到的cDNA樣品于-80℃保存，不得反復凍融，以便下一步進行熒光定量PCR檢測。

1.2.3外周血淋巴細胞總蛋白提取將由2 ml外周血提取得到的淋巴細胞溶液12,000 r/min離心10 min，棄上清液，離心管底可見白色團塊即為淋巴細胞。每個樣品加入RIPA裂解液50 μl及蛋白酶抑制劑0.5 μl，冰上放置1 h后，12,000 r/min離心10 min，上清液即為總蛋白溶液。利用分光光度計對總蛋白溶液濃度進行檢測。所得樣本保存于-80℃，將所有樣品的濃度調至同一水平，以便下一步進行Western Blot檢測。

1.2.4RT-PCR檢測將得到的cDNA樣本稀釋10倍后，利用SYBR熒光定量試劑盒(TaKaRa,大連)進行PCR擴增。反應條件為95℃10 min；以下三步40個循環：95℃15 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s；95℃ 1 min，55℃ 30 s,95℃ 30 s。以GAPDH基因為內參基因，PRKCI基因為目的基因，擴增條件的特異性根據Mx3005P儀器所帶軟件溶解曲線判定，所用PCR引物序列見表1。

表1　RT-PCR引物序列

1.2.5Western Blot檢測

將得到的總蛋白樣本使用經典的濕轉法Western Blot進行檢測，β-actin為內參基因，PRKCI為目的基因。根據β-actin和PRKCI蛋白分子量大小，選用10%分離膠進行電泳。所用抗體中，一抗均為兔源性抗人源性，二抗為羊源性抗兔源性。

1.3統計學分析

利用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量數據選擇獨立樣品T檢驗，計數數據選擇χ2檢驗。若檢驗所得P<0.05，則實驗組與對照組間數據有統計學差異。

2結果

2.1研究對象基本資料分析

研究對象基本資料分析見表2。在年齡、性別、合并癥等方面，兩組未見明顯統計學差異。在LDL-C上，急性心肌梗死組明顯高于對照組，P=0.044。在HDL-C上，急性心肌梗死組明顯低于對照組，P=0.004。

表2　研究對象基本資料

2.2RT-PCR結果分析

本研究中，目的基因及內參基因的溶解曲線均為單峰型，未見多個波峰。說明擴增引物特異性較強，反應條件合適，未出現非特異性擴增產物(見圖1)。RT-PCR所得結果每個樣本均重復檢測3次，并且標準差符合RT-PCR要求。采用2-ΔΔCt方法計算PRKCI基因的相對表達量。結果顯示在mRNA水平上，急性心肌梗死組PRKCI基因相對表達量為對照組的0.62±0.11，P=0.032(見表3)，同基因芯片中PRKCI基因表達減低是一致的[23]。

表3　各樣本RT-PCR的CT值

ΔΔCT=急性心肌梗死組ΔCT — 對照組ΔCT；CT值指循環數，單位為倍。

2.3Western Blot結果分析

本研究中，以β-actin為內參基因，PRKCI為目的基因。Western Blot結果顯示：急性心肌梗死組與對照組在β-actin蛋白表達上無明顯差異，說明兩組所加的蛋白樣品總量相當。在總蛋白樣品相同的條件下，兩組在PRKCI蛋白表達上出現顯著差異，急性心肌梗死組PRKCI蛋白表達明顯減低(見圖2)。Western Blot結果與RT-PCR結果一致，說明PRKCI基因不但在RNA水平上表達減低，并且導致PRKCI蛋白生成減少，并最終影響PRKCI蛋白參與調節的生物過程的功能失調。

A：內參基因GAPDH的溶解曲線；B：候選基因PRKCI的溶解曲線。

1-3為對照組，4-6為急性心肌梗死組。

3討論

本課題組前期的基因芯片實驗發現，PRKCI基因在急性心肌梗死患者外周血白細胞中顯著低表達。本研究通過擴大樣本量確定PRKCI基因在中國東北漢族急性心肌梗死患者中表達減低，在RNA及蛋白水平均檢測到該基因顯著低表達。

PRKCI基因屬于蛋白激酶C家族，該家族基因參與多種細胞反應，在早期對多種生物過程的發生產生重要影響[8，9]。K-ATP通道在動作電位的形成、冠狀動脈擴張等過程中均發揮重要作用。在心肌組織，蛋白激酶C可激活K-ATP通道。K-ATP通道異常調節導致心肌缺血后多種并發癥的發生，例如心律失常[10-12]。Bandyopadhyay等發現[13，14]，PRKCI基因通過胰島素介導的葡萄糖轉運調節血糖代謝。

在胰島素通路中，根據日本基因與基因組百科全書網站通路分析(http://www.kegg.jp/pathway/hsa04910)，胰島素與胰島素受體結合后激活PIP3及脯氨酸定向的蛋白激酶 1(PDPK1)，這兩者的激活進一步活化PRKCI蛋白，活化的PRKCI蛋白通過間接激活固醇調節元件結合轉錄因子1(SREBP-1C) 及脂肪酸合酶(FAS)而間接促進脂肪生成,同時促進乙酰輔酶A羧化酶α與葡萄糖的吸收。此外，脯氨酸定向的蛋白激酶 1可以使蘇氨酸蛋白激酶3(Akt3)磷酸化，后者可通過抑制cAMP的合成從而抑制脂肪代謝。另一方面活化的固醇調節元件結合轉錄因子1可以間接激活丙酮酸激酶(PYK)與葡萄糖激酶(GK)，而后兩者通過糖酵解途徑降低血糖。

根據KEGG進行通路分析發現，PRKCI蛋白的正常表達有利于促進脂肪生成、葡萄糖的降解、血小板的聚集，因此PRKCI蛋白低表達的人群應具有較低的血脂水平及較高的血糖水平。但現階段業界普遍認為急性心肌梗死患者低密度脂蛋白膽固醇偏高，與此通路分析相矛盾。但是，在前期細胞實驗中，我們利用RNA干擾載體特異性干擾離體大鼠心肌細胞，并以非干擾組細胞為對照，使實驗組PRKCI基因RNA及蛋白表達均減低而不影響其他基因表達。觀察發現與對照組相比，PRKCI基因干擾組培養基中LDL含量隨著時間改變濃度逐漸增高[15]，與此同時對照組培養基中LDL含量未見明顯改變。這說明PRKCI基因的低表達促進脂質合成。

在本研究中，急性心肌梗死組患者低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組高，這與先前細胞干擾結果相同，并與臨床大數據相符。急性心肌梗死組高密度脂蛋白膽固醇偏低，也與目前業界普遍認為此為保護介質，有利于抗血管粥樣硬化的形成。根據通路分析，PRKCI基因表達減低的患者應具有較高的血糖水平，本研究中急性心肌梗死組患者血糖平均水平較對照組高，但無明顯統計學差異，需在細胞實驗上進一步明確。急性心肌梗死組與對照組相比血小板計數無明顯統計學差異，而PRKCI基因影響血小板聚集，但由于本實驗未進行血小板功能的檢測，此現象仍需進一步研究。

近年來，疾病的個體化治療逐步被廣大醫學界重視，有針對性的個體化治療也會大大提高患者治療的有效性。本研究基于前期基因芯片結果，通過臨床易于獲取的血標本對急性心肌梗死患者PRKCI基因表達進行分析，發現該基因在急性心肌梗死患者中表達減低，其低表達促進血清低密度脂蛋白膽固醇的合成進而誘發冠狀動脈粥樣硬化，成為急性心肌梗死的病因之一。PRKCI基因可能作為急性心肌梗死診斷的分子標記，也可能作為治療的靶點對臨床診療提供幫助。

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基金項目：2008年教育部新世紀優秀人才；2009年吉林省科技廳資助項目(20090734)；2012年吉林省財政廳資助項目(2012009)

文章編號：1007-4287(2016)05-0810-04

(收稿日期：2015-05-14)