宮頸癌患者外周血PD-1檢測的臨床價值

伍金華,甄　波,陳建勇,牛映紅

(1.江門市中心醫院 檢驗科，廣東 江門529030；2.江門市中心醫院 婦科，廣東 江門529030)

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*通訊作者

宮頸癌患者外周血PD-1檢測的臨床價值

伍金華1*,甄波2,陳建勇1,牛映紅1

(1.江門市中心醫院 檢驗科，廣東 江門529030；2.江門市中心醫院 婦科，廣東 江門529030)

摘要：目的評價外周血PD-1檢測對宮頸癌早期診斷的臨床價值。方法采用流式細胞術檢測72例宮頸癌患者，63例同期CINⅢ患者和60名體檢健康婦女外周血PD-1含量。分析PD-1含量與宮頸癌臨床病理參數的相關性。利用受試者工作特征曲線(ROC)分析外周血PD-1對宮頸癌的診斷價值。結果宮頸癌患者外周血PD-1含量((15.23±1.05)%)顯著高于CINⅢ患者((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)及健康對照者((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01)。宮頸癌患者中，Ⅲ+Ⅳ期患者((16.85±1.74)%)高于Ⅰ+Ⅱ期((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01)；有淋巴結轉移患者((16.56±1.37)%)高于無淋巴結轉移患者((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)。宮頸癌患者外周血PD-1含量在不同分化程度及病理類型分組間無統計學差異。外周血PD-1診斷宮頸癌的曲線下面積(AUC)為0.925。當外周血PD-1取值為15.07%時，其診斷宮頸癌的敏感度和特異度分別為75.12%和88.47%。結論外周血PD-1可能是宮頸癌早期輔助診斷及預后判斷有益的標志物。

關鍵詞：宮頸腫瘤；PD-1；生物學標記；流式細胞術

(ChinJLabDiagn,2016,20:0779)

子宮頸癌(簡稱宮頸癌)是指發生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤。宮頸癌的發病率逐年升高[1]，早期診斷宮頸癌是治療和延長患者生存期的關鍵。宮頸癌的確診主要是依靠病理診斷，但是病理診斷是有創性檢查，且病理的早期陽性診斷率較低，不利于宮頸癌的早期篩查診斷和治療。因此，積極尋找一種簡便易行、創傷小、靈敏度高的新型腫瘤標志物對于宮頸癌的早期輔助診斷和治療具有非常重要的意義。

近年來的研究發現，程序性細胞死亡分子1(programmed death-1，PD-1) 作為免疫球蛋白超家族協同刺激分子的重要成員，在介導腫瘤細胞免疫逃逸中發揮著重要的作用，成為腫瘤檢出和預后判斷的新的生物學指標。PD-1 通過與其配體PD-L1 結合，抑制CD4 和CD8 T細胞的增殖和活化，負性調控機體免疫應答過程，從而介導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤生長[2]。本研究運用流式細胞術檢測了宮頸癌患者、宮頸鱗狀上皮內瘤樣病變Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasiam，CINⅢ)患者和健康對照者外周血PD-1含量，分析PD-1的表達與宮頸癌臨床病理特征的關系，旨在探討其對宮頸癌早期診斷的臨床價值。

1材料與方法

1.1標本來源

選擇2013年9月至2014年9月廣東省江門市中心醫院婦科宮頸癌患者72例，按國際婦產科協會(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2000 標準分期，年齡33-71歲，平均年齡49.2歲，中位年齡為51.5歲。選擇同期CINⅢ患者63例，年齡28-56歲，平均48.8歲，中位年齡為50.7歲。診斷均經組織病理學證實，均無其他合并癥。同期門診體檢健康婦女60名，年齡29-63歲，平均47.6歲，中位年齡為49.7歲。所有研究對象均為女性，均簽署知情同意書。3組研究對象要求年齡分布接近，差異無統計學意義，P>0.05。

1.2儀器與試劑

流式細胞儀、溶血劑(美國Beckman Coulter EPICS XL)；熒光抗體:PE-Cy5標記人CD3單抗、 PE標記人PD-1單抗、PE標記人PD-L1單抗和PE標記人IgGI同型對照抗體(美國EB公司)。

1.3方法

1.3.1流式細胞術細胞樣本的制備分別抽取3組研究對象EDTA-K2抗凝靜脈血3 ml，即時送檢制備CD3+PD-1+T細胞，具體加樣步驟為：5 μl CD3抗體+5 μl PD-1抗體+50 μl全血；輕微混勻后室溫避光保存30 min，加入250 μl溶血劑輕微混勻，室溫避光保存12 min，加1 mL流式細胞儀鞘液1 500 r/min 離心5 min洗滌,共洗滌2次，加500 μl鞘液重懸細胞,3 h內上機檢測。

1.3.2流式細胞樣本的檢測每次試驗均設立空白對照和同型對照。以SSC-FS設門，計數10000個淋巴細胞，觀察CD3+PD-1+T細胞的表達情況。計算CD3+PD-1+T細胞占淋巴細胞的比例,結果以陽性率(%)表示。

1.4統計學分析

2結果

2.1宮頸癌患者、CINⅢ患者和健康對照者外周血PD-1含量

本研究所采用的流式細胞術以FS-SSC設門(圖1A)，每次實驗均做同型對照，控制值約為0.5%(圖1B)。宮頸癌患者外周血PD-1水平為((15.23±1.05)%)，CINⅢ患者為((8.64±0.53)%)，正常健康對照者為((5.93±0.24)%)(圖1C1 -C3)。3組數據經方差分析結果顯示，差異有統計學意義，F=763．84，P<0.01。采用LSD-t檢驗進行兩組間兩兩比較，結果顯示宮頸癌患者外周血PD-1含量高于CINⅢ患者(t=5.61,P<0.01)及正常健康對照者(t=7.87，P<0.01)，CINⅢ患者PD-1含量高于正常健康對照者(t=4.76，P<0.01)。

2.2宮頸癌患者外周血PD-1含量與臨床病理特征的關系

宮頸癌患者外周血PD-1水平Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期(t=-3.46,P<0.01)，淋巴結轉移患者高于未見轉移的患者(t=-2.29,P<0.05)。宮頸癌患者外周血PD-1含量在腫瘤不同分化程度(t=0.62,P>0.05)及病理類型(t=-0.32,P>0.05)分組間無統計學差異。結果見表1。

2.3外周血PD-1對宮頸癌的診斷價值

對宮頸癌患者血液PD-1含量結合健康對照組做ROC曲線，其曲線下的面積(AUC)為0.925。根據ROC曲線選擇15.07%為臨界值時，靈敏度和特異度分別為75.12%和88.47%。

表1　　　　宮頸癌患者外周血PD-1含量與臨床病理特征的

3討論

PD-1是近年來發現的負性協同刺激分子，最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中利用消減雜交的方法得到的，大多數表達于活化T細胞、B細胞、巨噬細胞和骨髓細胞。PD-1與其配體PD-L1(B7-H1)或PD-L2(B7-DC)結合后，通過其胞漿尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序傳入抑制信號，導致腫瘤抗原特異性T細胞的凋亡或免疫無能，從而抑制免疫反應，進而促使腫瘤細胞的逃逸[3]。PD-1在肝癌、腎癌、胃癌等患者外周血都有顯著表達[4-6]，提示PD-1有望成為癌癥診斷治療又一觀察新指標。目前國內外尚未見有關PD-1在宮頸癌患者外周血表達及其臨床價值的報道。

注：FS為前向散射光強度；SS為側向散射光強度；FL2為PE標記PD-1表達熒光強度；FL4為PE-Cy5標記CD3表達熒光強度。

通過檢測宮頸癌患者、CINⅢ患者和健康對照者血液PD-1含量，我們發現宮頸癌患者的血液PD-1水平明顯高于CINⅢ患者和健康對照者(P均<0．01)，同時CINⅢ患者的血液PD-1水平也是明顯高于健康對照者(P<0.01)，這說明了血液PD-1濃度的升高與宮頸癌的發生密切相關，是宮頸癌發生的早期事件。大量臨床、分子生物學及流行病學資料已表明，人乳頭瘤病毒(HPV)是引起宮頸癌及CIN的主要病因，其在宮頸癌發生發展過程中引起的免疫逃逸機制引起各方研究關注。目前，Yang W等[7]學者分別檢測高危型HPV陰性和高危型HPV陽性婦女宮頸上皮細胞的PD-1，發現高危型HPV陽性婦女PD-1的含量顯著高于高危型HPV陰性婦女，而且高危型HPV陽性婦女PD-1含量與CIN分級呈正相關性，結果顯示PD-1/PD-L1信號途徑參與了HPV介導的宮頸慢性炎癥到宮頸癌發生發展的病理過程。Chang等[8]研究也發現，生殖器乳頭狀瘤PD-1+CD4+T細胞復發病灶中顯著增加，而且引起Th2細胞的升高，有助于免疫逃逸機制的產生。Karim R等進一步[9]指出，PD-1+CD8+T細胞和PD-1+CD4+Foxp3+T在宮頸癌患者宮頸組織中大量表達，提示阻斷PD-1的表達可能是宮頸癌免疫治療的新途徑。關于宮頸癌PD-1國內的報道并不多見，王渝琦等[10]指出表達PD-1 的T細胞凋亡是腫瘤免疫逃逸的原因之一，作者觀察了宮頸癌細胞表達PD-1的受體PD-L1 與腫瘤內浸潤淋巴細胞凋亡的關系，結果發現部分PD-L1 陽性的宮頸癌病例癌巢和間質內部分淋巴細胞發生了凋亡，故推測癌巢及癌巢邊緣浸潤的CD8+T細胞減少可能與PD-1/PD-L1途徑促進其凋亡有關。有關宮頸癌患者PD-1的研究目前多數集中于宮頸上皮細胞、宮頸癌病理組織這兩個載體上。我們的研究發現，PD-1在腫瘤原發病灶的表達可以通過血液循環系統的運轉而最終出現在外周血中。對于宮頸癌患者PD-1的檢測與追蹤復查而言，外周血來源方便，對患者的創傷性小，在某種程度上可以代替宮頸癌組織細胞學的檢測。通過進一步分析宮頸癌患者血液PD-1濃度與臨床病理特征之間的關系，可以發現Ⅲ+Ⅳ期患者血液PD-1水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(t=-3.46,P<0.01)，差異有統計學意義。分期的進展是預后不良的指標，結果說明了血液PD-1濃度過高預示著疾病進展、預后不良。同時，有淋巴結轉移患者PD-1水平也高于無淋巴結轉移患者(t=-2.29，P<0.05)。結果表明，宮頸癌患者T 淋巴細胞中高表達的PD-1,與其配體相互作用后,抑制了腫瘤抗原特異性T淋巴細胞的增殖和活化,使T淋巴細胞處于無能狀態,誘導并維持T 淋巴細胞對宮頸癌細胞免疫耐受,從而使宮頸癌細胞有效逃避機體的免疫監控和殺傷,使宮頸癌增殖得不到有效控制,導致宮頸癌的進一步增長,甚至發生轉移。而在不同的分化、病理類型之間，則未見PD-1的表達水平發生顯著性差異。ROC曲線分析表明，PD-1在早期診斷宮頸癌的發生以及轉移具有一定的準確性。在cut-off值為15.07%時，靈敏度為75.12%，特異度為88.47%。我們推測，PD-1有可能作為一種新型的生物標志物在將來單獨或與其他腫瘤標志物聯合應用于宮頸癌的早期輔助診斷及預后判斷。

綜上所述，外周血PD-1的變化在宮頸癌的臨床分期和侵襲轉移中發揮重要作用，有可能為宮頸癌的早期診斷和預后判斷提供有力依據。

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Clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in patients with cervical cancer

WUJin-hua1，ZHENBo2，CHENJian-yong1，etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China；2.Departmentofgynaecology,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical value of detection of peripheral blood PD-1 in the early diagnosis of cervical cancer.MethodsFlow cytometry was available to detect the PD-1 in peripheral blood from 72 patients with cervical cancer,63 patients with CINⅢ and 60 healthy controls，and the correlation of PD-1 and the clinical pathological parameters of cervical cancer was analyzed.The diagnostic performance of PD-1 in peripheral blood for cervical cancer was estimated by receiver operating characteristic (ROC) curve analysis.ResultsPD-1 in peripheral blood from cervical cancer group((15.23±1.05)%)were significantly higher than those of CIN III group ((8.64±0.53)%)(t=5.61,P<0.01)and healthy controls group((5.93±0.24)%)(t=7.87，P<0.01).Patients of stageⅢandⅣ((16.85±1.74)%)were significantly higher than those of stageⅠandⅡ((14.27±0.86)%)(t=-3.46,P<0.01),patients with lymph node metastasis ((16.56±1.37)%)were higher than those without lymph node metastasis ((14.83±0.96)%)(t=-2.29，P<0.05)．PD-1 in cervical cancer patients with different difierentiation degree and histological type showed no significant difference．The area under curve(AUC) of PD-1 in peripheral blood was 0.925.At the optimal cut-off of 15.07%,the diagnostic sensitivity and specificity were 75.12% and 88.47%.ConclusionThe 1evel of peripheral blood PD-1 may benefit the early aided diagnosis of cervical cancer and may play a role in the prognostic judgment．

Key words:uterine cervical neoplasms；PD-1；biological markers；flow cytometry

基金項目：廣東省江門市科技計劃項目(201471)

文章編號：1007-4287(2016)05-0779-04

中圖分類號：R446.1

文獻標識碼：A

作者簡介：伍金華(1979-)，男，36歲，副主任檢驗技師,碩士，研究方向：外周血PD-1流式細胞術檢測。

(收稿日期：2014-12-20)