GP210與原發性膽汁性肝硬化患者TLR3表達的關系及其臨床意義

楊鴻林,沈國榮,沈　昊,鈕麗萍,錢建平,龔燕萍,蔣廷旺，殷　雄*

(1.江蘇省吳江區第一人民醫院 檢驗科，江蘇 吳江215200；2.江蘇省常熟市醫學檢驗所，江蘇 常熟215500)

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*通訊作者

GP210與原發性膽汁性肝硬化患者TLR3表達的關系及其臨床意義

楊鴻林1,沈國榮1,沈昊1,鈕麗萍1,錢建平2,龔燕萍2,蔣廷旺2，殷雄2*

(1.江蘇省吳江區第一人民醫院 檢驗科，江蘇 吳江215200；2.江蘇省常熟市醫學檢驗所，江蘇 常熟215500)

摘要：目的探討原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血細胞TLR3的表達及其在GP210抗體陽性和陰性患者之間的表達差異。方法選擇初次確診的PBC患者65例，其中男15例，女50例。GP210抗體陽性患者21例，陰性患者44例。對照組選擇性別和年齡相匹配的慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者22例。對所有患者分離外周血單個核細胞(peripheral blood monuclear cell,PBMC)，抽提總RNA，定量PCR分析其TLR3的mRNA表達水平。分別以anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8和anti-TLR3抗體對PBMC進行染色，流式細胞術分析各細胞亞群中TLR3的表達情況。結果PBC組患者血清堿性磷酸酶(ALP)顯著高于CHB組(P=0.002)，而且GP210陽性PBC患者ALP高于陰性患者(P=0.004)。PCR結果表明，PBC組PBMC中TLR3的mRNA表達量顯著高于CHB組(P=0.01)，而且PBC組內GP210陽性患者表達高于陰性患者的表達水平(P<0.001)。流式細胞術分析結果發現，PBC組PBMC、CD3+、CD4+、CD8+T細胞表面的TLR3表達量均顯著高于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)；其中PBC組GP210陽性患者PBMC、CD3+ 和CD8+ T細胞表達量較GP210患者均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而CD4+ T細胞無顯著差異(P>0.05)。結論GP210陽性PBC患者中PBMC和T細胞表面TLR3的基因和蛋白表達水平均高于GP210陰性患者，TLR3的表達差異對于PBC的診斷和預后判斷具有一定臨床價值。

關鍵詞：原發性膽汁性肝硬化；GP210；Toll樣受體3；T細胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:0775)

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，好發于成年女性，以肝內小膽管破壞為早期病變特征，最終引起肝纖維化和肝硬化[1]。抗GP210抗體是近年來發現的對于PBC具有較高診斷價值的一種抗核抗體，研究發現其診斷特異性達到99.5%，但是其靈敏度相對較低，約為22.5%[2]。同時有研究證實GP210陽性PBC患者的病情較陰性患者更為嚴重，如膽汁淤積明顯、小葉性炎癥等病理損傷加劇[3]。

Toll樣受體3(Toll-like receptor-3,TLR3)的眾多生物學效應是在炎癥反應過程中通過其信號通路活化后完成的。盡管TLR3主要表達于樹突狀細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞中介導天然免疫應答，但是已經有研究發現其在多種適應性免疫應答相關細胞中也有表達，如抗原誘導的CD8+T細胞等[4,5]。但是TLR3在PBC患者T細胞中的表達及其與GP210存在怎樣的聯系目前并不明確，本研究將就此進行探討。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇常熟市第二人民醫院門診或住院的PBC初次確診患者65例，平均年齡58.1±9.3歲，其中男15例，女50例。其中GP210抗體陽性患者21例，陰性患者44例。PBC診斷標準為[6]：1)堿性磷酸酶(ALP)持續升高超過6個月；2)抗線粒體抗體(AMA)陽性；3)肝組織病理發現匯管區炎性浸潤或小膽管破壞。滿足以上三項中的任意兩項即可診斷為PBC。排除其他自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、藥物性肝炎患者。對照組選擇慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B,CHB)22例，平均年齡57.3±8.5歲，其中男5例，女17例。

1.2方法

1.2.1TLR3基因測定

收集各組患者外周血單個核細胞(peripheral blood monuclear cells,PBMCs)，抽提細胞總RNA，根據基因庫中人TLR3和β-actin的mRNA序列合成引物，以SYBR-Green法定量分析上述基因表達。TLR3上游引物：5’-TGAGTTAGATATGCGCTTTA-3’,下游引物：5’-TCAGGGATGTTGGTAT GG-3’；β-actin上游引物：5’-GAAATCTGTCAAAGTTCA-3’，下游引物：5’-AGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’。將總RNA反轉錄為cDNA，反應條件為：25℃ 10 min、48℃ 30 min、95℃ 5 min。在ABI Prism7000定量PCR儀上進行擴增，讀取閾循環值(threshold cycle，Ct)，根據公式：ΔCt = [Ct (目的基因)]-[Ct (內參基因)]和ΔΔCt =[ΔCt (研究組) ]-[ΔCt (對照組) ]，計算出2-ΔCt，以反映出目的基因在研究組中表達水平(相對于對照組)。

1.2.2流式細胞術分析TLR3

分離PBMCs，并將其以PBS稀釋至1×106/100 μl，將其分別與20 μl的anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8(BD,USA)等抗體進行室溫避光孵育30 min。然后將上述細胞分別與anti-TLR3(BD,USA)進行避光孵育，最后以流式細胞儀進行檢測，以flowjo軟件對結果進行分析。

1.2.3統計方法

2結果

2.1患者基本資料

表1為PBC和CHB患者實驗室檢查指標，其中年齡、AST、GGT、LDH兩組間差別無統計學意義，而CHB組患者ALT較PBC組有所增加，而ALP則顯著低于PBC組，差異有統計學意義。表2為PBC患者中GP210陽性患者和陰性患者的實驗室檢查指標，其中ALT、AST、GGT和LDH差異無統計學意義，但是GP210陽性組ALP水平顯著高于GP210陰性組，差異有統計學意義。

表1　PBC和CHB患者實驗室檢查結果

表2　　　GP210陽性和GP210陰性PBC患者實驗室

2.2TLR3基因表達情況

定量PCR對PBC和CHB患者外周血單個核細胞TLR3相對于β-actin的mRNA表達情況分析發現：PBC組和CHB組分別為1.71±0.81和1.22±0.54，差異有統計學意義(P=0.01，t=6.96)；PBC組內GP210陽性患者和GP210陰性患者表達量分別為2.10±0.84和1.66±0.76，差異有統計學意義(P<0.001，t=16.5)。

圖1各組患者PBMC中TLR3基因相對表達水平，圖1A)：PBC患者和CHB患者PBMC中TLR3基因表達水平；圖1B)：GP210陽性和陰性PBC患者PBMC中TLR3基因表達水平

2.3TLR3在外周血不同亞群細胞表面的表達情況

以流式細胞術對PBC和CHB患者外周血PBMCs、CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞表面TLR3的表達進行分析發現，PBC組PBMC、CD3+ T、CD4+ T、CD8+ T細胞的TLR3表達百分比分別為12.8%(8.4%-24.5%)、11.5%(6.3%-25.7%)、5.5%(3.2%-7.2%)、4.7%(3.3%-8.5%)；CHB組分別為4.8%(1.5%-10.2%)、2.0%(1.1%-3.2%)、2.6%(0.8%-4.5%)、1.3%(0.9%-2.1%)。GP210陽性組不同細胞TLR3表達量為14.2%(8.4%-25.4%)、12.2%(9.6%-22.5%)、5.6%(3.2%-7.6%)、8.5%(6.2%-9.6%)、5.8%(4.2%-7.6%)；GP210陰性組分別為10.1%(6.5%-14.2%)、7.8%(3.6%-14.2%)、7.5%(5.3%-8.6%)、5.8%(4.2%-7.6%)。如圖2所示：PBC組不同細胞亞群表面的TLR3表達量均顯著高于CHB組，差異有統計學意義；其中PBC組GP210陽性患者PBMC、CD3+ 和CD8+ T細胞表達量較GP210患者均顯著升高，差異有統計學意義，而CD4+ T細胞無顯著差異。

圖2各組患者不同細胞亞群表面TLR3表達情況，圖2A)PBC和CHB患者外周血不同細胞TLR3表達情況；圖2B)GP210陽性和陰性PBC患者PBMC中TLR3表達水平。

3討論

T細胞在多種肝臟炎癥及實質性病變過程中均發揮重要作用，但是也有很多研究提示，單獨的自身反應性T細胞不足以直接引起組織損傷，還需要一些其他的介導炎性反應的信號分子[7]?；谧陨砻庖咝约膊⌒∈竽Ｐ偷难芯堪l現，TLR3的活化能夠加劇病情，并導致自身反應性CD8+T細胞的增加[8]。

細胞免疫在PBC匯管區病理損傷過程中具有重要作用，其中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞在匯管區的大量浸潤表明其在PBC膽管上皮細胞損傷中通過介導的適應性免疫應答發揮主導作用。TLR樣受體在各種炎性疾病中均發揮重要作用，不僅通過適應性免疫應答，而且作用于天然免疫系統，還可以誘導Th1型免疫應答參與免疫炎癥的調節。本研究發現PBC患者外周血單個核細胞TLR3的mRNA表達較慢性肝炎組顯著升高。研究已經證明TLR3通過激發適當的免疫應答在抗病毒過程中具有重要作用[9]。本研究發現PBC患者TLR3的表達較HBV慢性感染者明顯升高，提示TLR3在PBC疾病的進程中可能具有十分重要的作用。進一步對GP210陽性和陰性患者分析發現，GP210陽性患者的TLR3表達高于GP210陰性患者。盡管GP210的陽性率沒有AMA高，但是其在PBC的診斷中具有很高的特異性，近年來的研究越來越提示其對于PBC的高診斷價值[10]。對于GP210對PBC疾病本身的影響國內外也有較多研究，Nakamura等研究發現，GP210陽性和陰性患者的生化參數并無顯著差別，但是Muratori等人卻發現GP210陽性患者膽汁淤積癥狀和肝損傷情況明顯加劇[11,3]。本研究同樣發現PBC患者中GP120陽性和陰性患者的肝功能大部分都無統計學差異，而反映膽汁淤積的ALP則GP210組明顯升高，這與國外同類研究基本一致。而GP210陽性組TLR3表達升高可能說明這部分患者中TLR3介導的天然免疫應答明顯增強，可能通過該途徑加劇了PBC疾病的進程和肝臟損傷程度。

T細胞是引起PBC膽管上皮細胞損傷的主要效應細胞[6]。為了進一步明確PBC患者中TLR3在不同免疫細胞中的表達情況，我們以流式細胞術進行分析發現，PBC患者PBMC、CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞表面的TLR3表達量均高于CHB患者組，說明TLR3的活化對T細胞介導的PBC病理損傷可能發揮重要的免疫調節作用。Meyer T等人在對T細胞的體外研究發現，TLR3的活化與CD3共同作用促進CD4+T細胞相關炎癥因子的釋放，促進炎癥反應[12]。因此，PBC患者T細胞表面TLR3表達的升高可能使得T細胞在PBC微環境中的炎癥介質釋放顯著增加，從而加劇病理損傷和肝纖維化、肝硬化的病程進展。對GP210陽性和陰性患者進行進一步統計分析發現，除CD4+T細胞之外，其他細胞TLR3的表達GP210陽性組均高于陰性組。提示GP210陽性患者T細胞中TLR3活化程度明顯升高，CD4+T細胞表達沒有改變而CD8+T細胞表達顯著升高可能與PBC的病理特征存在關聯性，因為PBC患者的膽管上皮細胞自身免疫性損傷主要由CD8+T細胞介導，而GP210陽性患者CD8+T細胞TLR3表達升高印證了這一點，同時也說明TLR3的升高對于PBC病情加劇具有重要的免疫調節作用。

綜上所述，本研究從基因和蛋白水平分別發現TLR3在PBC患者中表達顯著升高，而GP210陽性患者中的表達較陰性患者明顯增加，T細胞表達升高尤其顯著，說明GP210與TLR3在PBC中的表達存在一定聯系，且TLR3的表達異?？赡茉谝欢ǔ潭壬霞觿×薖BC的進程。

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Correlation of GP210 with Expression of TLR3 in Primary Biliary Cirrhosis

YANGHong-lin,SHENGuo-rong,SHENHao,etal.

(TheFirtsHospitalofWujiangDistrict,Wujiang215200,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of TLR3 in peripheral blood of patients with primary biliary cirrhosis (PBC) and its difference in GP210 positive and negative patients.Methods65 patients with PBC were involved in this study,male 15,female 50.21 patients with GP210 positive and 44 patients with GP210 negative.peripheral blood monuclear cells (PBMC) were isolated and total RNA was extracted for TLR3 mRNA determination.PBMC were stained with anti-CD3,anti-CD4,anti-CD8 and anti-TLR3,and assayed by flow cytometry.ResultsHigher levels of alkaline phosphatase (ALP) in PBC than that in CHB were found (P=0.002).GP210 positive PBC patients with higher levels of ALP than those of negative patients (P=0.004).Results of PCR showed that TLR3 mRNA in patients with PBC was higher than those with CHB (P=0.01).Furthermore,GP210 positive patients express moreTLR3 mRNA than negative patients (P<0.001).Results of flow cytometry showed that TLR3 in PBMC,CD3+,CD4+ and CD8+T cells in patients with PBC were higher than that in CHB patients (P<0.05).TLR3 in PBMC,CD3+ and CD8+ T cells in GP210 positive patients were higher than those in negative patients (P<0.05),however,no clinical significance was found in CD4+ T cells (P>0.05).ConclusionmRNA and protein levels of TLR3 in PBMC and T cells of GP210 positive patients were significantly higher than that in GP210 negative patients,which maybe in diagnosis and prognosis in PBC.

Key words:primary biliary cirrhosis;GP210;TLR3;T cells

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863計劃子任務：2014AA022304)，常熟市科技發展計劃社會發展項目(CS201218，CS201313，CS201417)

文章編號：1007-4287(2016)05-0775-05

中圖分類號：R575.2

文獻標識碼：A

作者簡介：楊鴻林(1977-)，男，碩士，主要從事肝病的發病機制研究。

(收稿日期：2015-11-24)