新的腫瘤抑素對C6腦神經膠質瘤體外實驗研究

孫　波，劉嘉婧，劉曉陽，孫亞娟，周慶偉，權　威，陳加俊*

(1.吉林大學藥學院,吉林 長春130021；2.吉林省食品藥品認證中心；3.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科)

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*通訊作者

新的腫瘤抑素對C6腦神經膠質瘤體外實驗研究

孫波1，劉嘉婧2，劉曉陽3，孫亞娟3，周慶偉1，權威3，陳加俊3*

(1.吉林大學藥學院,吉林 長春130021；2.吉林省食品藥品認證中心；3.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科)

神經膠質瘤是顱內最常見的原發腫瘤，呈浸潤性生長，且術后復發率高，嚴重威脅患者的生命健康。目前神經膠質瘤的發病機制尚未十分清楚，據文獻報道，神經膠質瘤的發生、發展與細胞凋亡密切相關[1-3]。其傳統的治療原則是術后先放療后化療，或單獨放療/化療，但都難以提高其臨床療效[4]，治愈率仍較低。近年來，研究者們通過大量的基礎研究正在尋求治療腦神經膠質瘤的新策略。目前國內外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數價格昂貴且不良反應大，同時也存在耐藥性問題，使其臨床應用受到一定限制[5-7]。為此，尋找高效、低毒、價廉的新的治療藥物成為近年來研究的熱點。本實驗旨在研究一種新的腫瘤抑素對C6腦神經膠質瘤細胞作用的影響，并通過檢測神經膠質瘤細胞侵襲及細胞周期蛋白D1表達變化，初步探討其抑制神經膠質瘤細胞的可能作用機制，為進一步研究新的腫瘤抑素在臨床上治療神經膠質瘤提供了新的理論依據。

1材料與方法

1.1細胞、主要試劑及藥品

1.2主要儀器

(1)倒置顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養箱 (日本 三樣電機株式會社制造 產品型號：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超凈臺 (中國 蘇州安洋科技發展有限公司 型號：BSC-BOOⅡB2)；(4) Transwell24板由美國Corning Incorporated生產；(5) 酶標儀(中國 上海BIO-RAD公司，MODEL550型)；凝膠成像系統(中國 深圳市宇德立生物科技有限公司，170-8170)。

1.3Transwell小室侵襲實驗法檢測細胞侵襲能力(1) 將Martrigel基質膠與DMEM在4冰箱預冷，將Martrigel基質膠與DMEM按1∶7比例充分混勻后加入Traswell小室中，每孔200 μl，置入37℃培養箱20 min，將上層培養基吸出；(2) 取對數生長期C6腫瘤細胞消化﹑計數為5×104，每小室加入100 μl細胞懸液后，隨機分為5組，分別為正常對照組，卡莫司汀組，及不同濃度新的腫瘤抑素(1 000 μg/ml﹑1 500 μg/ml﹑2 000 μg/ml)組。(3) 將30%培養液通過孔隙加入下層中，每孔500 μl。置入37℃、5%CO2孵箱，培養48 h；(4) 棄去上下層培養基，Transwell小室上下層各加入10%甲醛500 μl室溫固定20 min,棄去,500 μl PBS洗兩次后，上下層各加400 μl，1%結晶紫，20 min后棄去結晶紫。上下層各用PBS洗2次，末次不棄。(5) 顯微鏡下拍照。

1.4Western Blot檢測細胞周期蛋白-D1的表達

(1)取對數生長期C6神經膠質瘤細胞，0.25%胰酶消化計數。調整細胞懸液1×106Cells/ml接種六孔板中，1 ml/孔,37℃、5% CO2培養4 h，(2) 實驗分組(見方法2.1)，每組設3個復孔，除正常對照組外，其余每孔加不同的藥物均為500 μl，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養48 h；(3)冰上裂解提取細胞總蛋白，采用BSA蛋白定量檢測試劑盒測定所提取蛋白的濃度；(4)取50 μg蛋白上樣量，經15%的SDS-PAGE電泳，采用電轉印法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜；(5)膜在5%脫脂奶粉封閉 1 h，加兔抗鼠Cyclin-D1(1∶300)，4℃搖床封閉過夜；(6)TBST洗滌15 min×3次，加入羊抗兔二抗(1∶3 000)，室溫孵育60 min；(7)TBST洗滌15 min×3次，取等體積ECL顯色A液和B液，加到PVDF膜上，處理1 min后，將膜放入凝膠圖像儀，曝光5 min，特異性條帶的信號采用凝膠圖像分析系統處理。蛋白表達灰度值=各組條帶的灰度值/對應的β—actin條帶的灰度值

1.5統計學分析

2結果

2.1Transwell小室實驗結果不同濃度新的腫瘤抑素對C6神經膠質瘤細胞侵襲能力具有不同程度的抑制作用。其中新的腫瘤抑素(1 500μg/ml，2 000μg/ml)組及卡莫司汀組與正常對照組比較具有統計學意義(P<0.05)；卡莫司汀組與新的腫瘤抑素(2 000μg/ml)劑量組比較無統計學意義(P>0.05)(見表1及圖1)。

表1　　　　新的腫瘤抑素對C6神經膠質瘤細胞侵襲能力的

#P<0.05，與正常對照組比較;※P>0.05，與卡莫西汀組比較

2.2新的腫瘤抑素對細胞周期蛋白-D1表達的影響

Western Blot結果顯示，不同濃度的新的腫瘤抑素對C6神經膠質瘤細胞周期蛋白-D1的表達具有一定的調節作用，正常對照組與新的腫瘤抑素各組及卡莫西汀組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，同時也顯示，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無統計學意義(P>0.05)。結果表明新的腫瘤抑素對細胞周期蛋白-D1的表達具有一定的調節作用 (見表2及圖2)。

圖1　Transwell小室實驗結果

表2　　　新的腫瘤抑素對細胞周期蛋白D1表達的

*P<0.05，與正常組比較,ΔP>0.05,與卡莫西汀組比較

圖2　Western Blot檢測結果

3討論

近年來，惡性腫瘤發病率呈現逐年攀升的趨勢，在腦腫瘤中以惡性膠質瘤的發病率升高最為明顯[8]，約占顱內腫瘤的35-60%以上[9]。由于該病的發病機理目前仍不清楚，故其治療一直沒有重大突破。目前主要通過手術治療，并聯合化療、放療以減少腫瘤的復發及轉移，但其治愈率仍較低，對其治療至今尚無突破性進展。故對于神經膠質瘤的有效治療手段已成為臨床研究的熱點。

據文獻報道，國內外已研究出的抗腫瘤藥物眾多，但多數價格昂貴且不良反應大，同時也存在耐藥性問題，使其臨床應用受到一定限制[10-12]。為此，尋找高效、低毒、療效穩定的抗腫瘤藥物是目前研究開發的重點，而多肽藥物恰恰具備了這些優點。另有研究報道，增殖和侵襲是惡性腫瘤最為明顯的生物學特征，也是惡性腫瘤難以治愈的根本原因。如何抑制惡性腫瘤增殖和侵襲對控制惡性腫瘤進展具有重要意義[13-15]。

本實驗采用Transwell小室侵襲實驗法檢測細胞侵襲能力。結果顯示，新的腫瘤抑素(1 500 μL/mL)﹑新的腫瘤抑素(2 000 μL/mL)組分別與正常對照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)。這表明新的腫瘤抑素對C6神經膠質瘤細胞具有明顯抑制其侵襲的作用。

多項研究表明，細胞生長周期為G1→S→G2→M期，在此細胞周期中，G1→S期、G2→ M期被認為是關鍵點，并且G1→S期對細胞的增殖存在重要影響。Cyclin-D1作為G1期細胞周期素，在G1/S期轉換中發揮重要作用[16]。生理狀態下，細胞進入S期后Cyclin-D1迅速分解，若Cyclin-D1基因激活并持續高表達，則導致G1期縮短，提前進人S期，繼而導致遺傳基因突變和染色體結構異常的細胞獲得增殖能力，引發細胞增殖失控，最終形成腫瘤[17]。本研究為進一步探討新的腫瘤抑素對細胞周期及細胞周期蛋白-D1表達的影響。同時采用Western blot檢測，結果也證實了不同濃度的新的腫瘤抑素對C6腦神經膠質瘤細胞的細胞周期蛋白-D1的表達有一定的調節作用，新的腫瘤抑素(1 500 μl/ml)、新的腫瘤抑素(2 000 μl/ml)組及卡莫西汀組與正常對照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)，新的腫瘤抑素(2 000 μg/ml)組與卡莫西汀組比較無統計學意義(P>20.05)。結果證實，新的腫瘤抑素可能通過下調細胞周期蛋白D1的表達，抑制C6神經膠質瘤細胞侵襲能力。本研究為新的腫瘤抑素治療神經膠質瘤的臨床應用提供了新的實驗依據。

參考文獻：

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C6腦神經膠質瘤細胞株：購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

主要試劑：(1) 結晶紫由天津光復精細化工研究所生產；(2) 新的腫瘤抑素由本研究室設計，由上海吉爾公司合成，純度為98%；(3)卡莫司汀由天津金耀藥業有限公司生產(批號：1407011)；Rabbit Anti—Cyclin-D1、HRP羊抗兔IgG、Anti-beta-Actin均由武漢博士德生物工程有限公司生產；PageRuler預染蛋白Ladder由賽黙飛世爾科技(中國)有限公司生產；RIPA裂解液由碧云天生物技術研究所(中國)生產。

基金項目：吉林省發展和改革委員會課題項目(JF2012C008_4)

文章編號：1007-4287(2016)05-0707-03

作者簡介：孫波(1965-)，男，副教授，主要從事藥理學研究;陳加俊，教授，研究方向：神經病學。

(收稿日期：2015-11-19)