馬鈴薯吉科6號莖尖脫毒及組織快繁研究

韓艷曹麗李闖姚琪譚化王洋王娜于婭王忠偉

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002； 2.吉林省農業科學院，吉林 長春 130033)

馬鈴薯作為全球第4種主要作物，產量高、營養豐富、適應性強，是生活中不可缺少的蔬菜、糧食作物，同時也是能為農民增加收入的經濟作物，在吉林省地區廣泛種植。在連年的種植中，由于病毒的侵染和積累，導致馬鈴薯植株葉片卷曲壞死、莖稈矮小細弱，塊莖畸形龜裂，產量逐年降低[1]。目前，馬鈴薯莖尖脫毒技術已經被廣泛應用，其利用馬鈴薯細胞的全能性及病毒在根尖和莖尖的分生組織中含量少或不含的特性[2]。在實際操作中，不同馬鈴薯品種的脫毒方式、莖尖大小、培養基中生長調節劑的成分、培養條件及快繁培養基成分、試管薯誘導環境存在顯著差異。“吉科6號”馬鈴薯是吉林吉科生物高技術公司選育的新品種，具有薯塊大而整齊、大薯率高、營養豐富等特點，但該品種莖尖培養成苗困難，成活率不高，生長緩慢，出現黃化死亡的現象。在進行異地快繁時，由于試管苗不易儲存，運輸中損耗較大，將試管苗誘導出試管薯可以有效改變這種現狀，顯著降低長途運輸中的損耗，本研究對“吉科6號”馬鈴薯脫毒方式和組織快繁培養基組分進行了優化，篩選出適宜的試管薯誘導條件，建立了“吉科6號”脫毒快繁技術體系，為實現“吉科6號”馬鈴薯的工廠化育苗及種薯快繁提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“吉科6號”，塊莖橢圓形，薯皮光滑、黃色，薯肉黃色，芽眼淺。由吉林省農業科學院經濟植物研究所馬鈴薯課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同消毒方法比較

選擇健康的馬鈴薯塊莖在室溫下進行催芽，待芽長3cm時，切取1cm長的莖芽作為試驗材料，對莖芽進行消毒處理。試驗設計6個處理，設置3次重復。每個處理30個芽，調查并記錄相應的數據。具體試驗設置見表1。

1.2.2 不同莖尖大小比較

在無菌條件下，將接種材料消毒后，剝離不同大小的莖尖并分析莖尖的分化生長情況。莖尖大小分別為0.1～0.2mm、0.2～0.3mm、0.3～0.4mm、0.4～0.5mm、0.5～0.6mm，每個處理30個芽，重復3次。接種到相同的誘導培養基，調查并記錄相應的數據。

1.2.3 不同激素濃度配比對馬鈴薯莖尖成苗率的影響

將MS培養基作為基礎，因為生長調節劑6-BA對芽的誘導能力強于GA3和NAA[3]，因此采用張媛媛[4]的方法，將NAA、GA3濃度固定為0.1mg·L-1同時調節6-BA的使用濃度。試驗設計6個處理，每個處理30個芽，設置3次重復。調查并記錄相應的數據。具體試驗方案見表2。

表1 不同消毒方式

表2 不同培養基成分

1.2.4 莖段快繁

將誘導獲得的脫毒小苗切去莖尖后，切成帶單個腋芽的莖段，將其插入含有不同成分不同濃度多效唑PP333、矮壯素CCC、丁酰肼B9、助壯素PIX的培養基中進行擴繁，以MS培養基作為對照組，試驗設置3個處理，每個處理30瓶，每瓶10個莖段。3次重復。25d后觀察分析莖段的生長狀況并記錄相應的數據。具體試驗方案見表3。

1.2.5 誘導形成試管薯

當脫毒試管苗長有6～7片葉時，去掉頂芽，取中部4～5個莖段進行馬鈴薯試管薯誘導培養。培養基采用MS培養基，不添加任何生長調節劑，誘導期間不更換培養基。試驗設置9個處理，每個處理30瓶，每瓶10個莖段，3次重復。光照時間為8h·d-1，誘導4周，再進行4周全黑暗誘導。全黑暗誘導4周后進行收獲，統計每個處理試管秒誘導生產試管薯的大薯數(≥0.05g)、大薯重、小薯數(<0.05g)、小薯重、結薯數和結薯重，并進行數據分析。具體試驗方案見表4。

表3 不同培養基成分

表4 誘導環境

1.2.6 數據分析

數據采用WPS進行處理，DPS 7.05軟件進行統計分析。

莖尖成活率=成活莖尖個數/接種莖尖個數

接種3個月后統計。

莖尖成苗率=成苗莖尖個數/成活莖尖個數

接種6個月后統計。

脫毒率=無病毒株數/檢測株數

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法比較

試驗選擇0.1%升汞和0.1%NaClO作為主要滅菌劑，研究不同浸泡時間對消毒效果的影響，結果如表5所示，隨著滅菌時間的增加，染菌率和成活率均呈現下降的趨勢，根據各處理結果對染菌率及成活率的影響，推薦采用自來水沖洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加無菌水沖洗2次的消毒方法用于馬鈴薯“吉科6號”莖芽消毒處理，染菌率降至17%的同時可以保障成活率達到92.22%。

表5 不同消毒方法對莖尖染菌率及成活率的影響

2.2 不同莖尖大小比較

由表6可以看出，馬鈴薯“吉科6號”成活率與莖尖剝離的大小呈正相關，成活率隨著莖尖剝離長度的增加而逐漸升高：與脫毒率呈負相關，脫毒率隨著莖尖剝離長度的增加而逐漸降低。在本試驗條件下，適宜馬鈴薯“吉科6號”剝離莖尖最佳大小為0.3～0.4mm，脫毒率達到48.89%，成活率達到49.6%。

表6 不同莖尖大小對脫毒率及成苗率的影響

2.3 不同激素濃度配比對馬鈴薯莖尖成苗率的影響

生長調節激素赤霉素GA3能抑制愈傷組織的形成，且有助于馬鈴薯莖尖生長和分化；細胞分裂素6-BA可誘導芽的分化，但不利于莖的伸長；生長素NAA可促進莖的伸長，但不利于芽的分化增殖，將上述3種激素混合使用，可以有效調節馬鈴薯試管苗的生長。由表7可以看出，生長調節激素6-BA、NAA、GA3對馬鈴薯莖尖的誘導分化影響顯著，在本研究中，處理2的成活率最高為93.33%，與處理3之間不存在顯著性差異，與其他處理均存在顯著性差異；處理3的成苗率最高為74.07%，與其他處理存在顯著性差異，因此，綜合分析得出，在本試驗中最適宜馬鈴薯“吉科6號”的生長調節劑組合是MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA。

表7 不同生長調節激素組合調節下馬鈴薯莖尖成苗情況

2.4 不同成分培養基對莖段生長的影響

表8 不同培養基中莖段生長情況

由表8可以看出，在添加各種生長延緩劑的培養中，雖然馬鈴薯“吉科6號”試管苗在對照培養基中根長、株高顯著大于其他處理，但是在生根率、莖粗、新增單芽節數方面明顯低于其他處理。使用過生長抑制劑的處理植株變得矮而粗壯，更有利于移栽及試管薯的誘導。在本試驗中，MS加PIX 0.5mg·L-1的培養基組合，對促進馬鈴薯“吉科6號”脫毒苗生根，增加莖粗，抑制徒長，促進壯苗等綜合效果最佳。

2.5 誘導形成試管薯

由表9可以看出，當溫度在20℃，光照強度為80μmol·m-2·s-1，光照8h·d-1，誘導4周，黑暗誘導4周，結薯數2218.96個和結薯重14.84g顯著高于其他處理，是最適宜馬鈴薯“吉科6號”的試管薯誘導方法。

表9 溫度和光照強度對試管薯形成的影響

3 討論與結論

影響馬鈴薯莖尖脫毒效果及脫毒苗快繁、試管薯誘導的因素有很多。外植體的消毒是馬鈴薯莖尖脫毒技術取得成功的基礎，對于莖尖的處理既要使其不受污染，又要確保其成活狀態，現有的研究報道表明[5]，氯化汞或次氯酸鈉與75%乙醇組合使用對馬鈴薯莖尖的消毒效果較好；莖尖剝離的大小是影響馬鈴薯莖尖脫毒的關鍵因素，現有的研究表明[6]，莖尖剝離保留1～2個葉原基，可以保證莖尖的脫毒率及成活率；在MS培養基中加入生長調節劑GA3、6-BA、NAA制成分化培養基，分化培養基的成分及濃度是影響成苗的關鍵，濃度過低會出現大量愈傷組織無法分化成苗，濃度過高，會出現黃化現象，導致成活率降低，現有研究表明[7]，上述常用的3種生長調節劑對馬鈴薯的作用存在差異。多效唑(PP333)、矮壯素(CCC)、丁酰肼(B9)和助壯素(PIX)等生長延緩劑，可增強試管苗的適應性和抗性，能顯著提高移栽成活率。研究表明[8]，影響馬鈴薯試管薯形成的因素很多，溫度、光照、黑暗誘導時間、馬鈴薯品種等。

鑒于已有的研究報道結果，本研究以馬鈴薯新品種“吉科6號”莖尖為外植體，對其消毒方式、剝離莖尖大小、生長調節劑成分、快繁培養基組分、試管薯誘導環境進行了優化。在本試驗中，確定了用自來水沖洗20min加0.1%升汞浸泡7min加75%乙醇浸泡1min加無菌水沖洗2次對馬鈴薯“吉科6號”莖芽消毒處理后，污染率降至17%；確定莖尖剝離長度為0.3～0.5mm，脫毒率48.89%，成活率49.6%；用MS加0.1mg·L-1NAA加0.1mg·L-1GA3加0.15mg·L-16-BA培養基誘導莖尖分化成苗，成活率90%，成苗率74.07%。再經MS加PIX 1.0mg·L-1培養基繼代，可獲得大量健壯的馬鈴薯無菌種苗，之后在培養室內溫度調至20℃，光照強度調至80μmol·m-2·s-1，光照時間調至8h·d-1，誘導4周，之后全黑暗誘導4周，可以獲得大量試管薯，滿足長途運輸及工廠化生產的目標。