乙肝病毒在早期胚胎中復(fù)制情況實(shí)驗(yàn)研究

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金　燕　呂頤菲　邱　婷　王　雪　高淑娟　閆春英　劉貴生

?

乙肝病毒在早期胚胎中復(fù)制情況實(shí)驗(yàn)研究

陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科(西安710068)

金燕呂頤菲邱婷王雪高淑娟閆春英劉貴生

摘要目的：觀察HBV會在早期卵裂胚胎中復(fù)制情況，探討HBV在早期胚胎內(nèi)的生物學(xué)活性。方法：選取行輔助生育技術(shù)治療女方或男方有一方或雙方患有慢性乙肝夫婦的廢棄胚胎為實(shí)驗(yàn)組，同期HBV陰性的廢棄單細(xì)胞卵裂胚胎作為陰性對照組。采用單細(xì)胞RT-PCR方法檢測早期卵裂胚胎中的HBV mRNA。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組62個(gè)卵裂胚胎中有6個(gè)檢測到特異性HBV mRNA片段，陽性檢出率 9.7%(6/62)。女方HBV標(biāo)志物陽性、男方HBV標(biāo)志物陽性和夫妻雙方HBV標(biāo)志物陽性的卵裂胚胎陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)。結(jié)論：在早期卵裂胚胎內(nèi)存在的HBV具有復(fù)制活性使胚胎感染HBV，發(fā)生真正意義上的經(jīng)卵細(xì)胞途徑的HBV母嬰垂直傳播。

主題詞 乙型肝炎病毒胚胎發(fā)育病毒復(fù)制多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

目前研究證實(shí)乙型肝炎病毒的母嬰傳播是造成HBV感染慢性化的主要原因。多項(xiàng)研究結(jié)果[1-3]證實(shí)，HBV可以穿過透明膜和細(xì)胞膜進(jìn)入卵母細(xì)胞并在卵細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和增殖，但是這些并不足以證明HBV會經(jīng)卵細(xì)胞將感染傳遞到下一代，要得出這個(gè)結(jié)論尚需要解決幾個(gè)關(guān)鍵問題，即：①在自然受精時(shí)，存在HBV DNA的人卵母細(xì)胞是被選擇性剔除還是能順利地完成受精過程而將HBV帶入受精卵;②在早期胚胎中存在的HBV是以片段整合于宿主細(xì)胞還是具有復(fù)制活性？本研究借助進(jìn)行體外受精人群，利用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)了解HBV mRNA在單細(xì)胞卵裂胚胎中的情況，分析HBV在早期胚胎內(nèi)的復(fù)制活性。

材料和方法

1材料選取2010年6月至2011年12月在陜西省婦幼保健院生殖中心行輔助生育技術(shù)治療女方或男方或夫妻雙方均患者乙肝的62個(gè)廢棄胚胎作為實(shí)驗(yàn)組；同期進(jìn)行體外受精的50例夫婦雙方HBV兩對半檢測均為陰性的76個(gè)廢棄胚胎作為陰性對照組。所有乙肝患者符合以2000年全國病毒性肝炎學(xué)術(shù)會議(西安)修訂的慢性病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者在手術(shù)前于肘靜脈處抽取10ml靜脈血，分別用于血清HBV DNA定量檢測，和HBVM檢測(送生化實(shí)驗(yàn)室完成)。同時(shí)檢測患者血清中HAVM、HAV、HCV、HDV和HIV抗體，排除有上述病毒的感染。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞裂解：將廢棄單細(xì)胞卵裂胚胎置于分裝的裂解液，按照Invitrogen的Superscript III First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，整個(gè)反應(yīng)在冰上進(jìn)行。用Oligo6.0生物軟件設(shè)計(jì)管家基因β-actin的引物[4]。根據(jù)HBV的S區(qū) mRNA基因序列[5]。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃ 3min，變性：94℃ 50s，56℃ 50s，延伸：72℃ 50s,30個(gè)循環(huán)→72℃延伸10min后，進(jìn)行第二輪PCR。條件和步驟同第一輪。

2.2對照選擇：陰性對照：選擇夫妻雙方HBV兩對半檢測均為陰性的廢棄胚胎，轉(zhuǎn)錄過程中不加模板，轉(zhuǎn)錄中不加逆轉(zhuǎn)錄酶，不加模板的PCR反應(yīng)體系，空白對照代替模板。PCR擴(kuò)增時(shí)不加Taq酶。陽性對照為HBV患者陽性血清DNA。

結(jié)果

1RT-PCR結(jié)果

1.1所有單細(xì)胞卵裂胚胎置于裂解液后在同一EP 管中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴(kuò)增管家基因β-actin，擴(kuò)增片段長度為179bp。除了陰性對照，每管都擴(kuò)增出目的片段(圖1)。

圖1　β-actin擴(kuò)增電泳圖

擴(kuò)增產(chǎn)物為管家基因β-actin，擴(kuò)增片段長度為179bp。除了陰性對照，每管都擴(kuò)增出目的片段。

1.2 用巢式PCR擴(kuò)增出目的片段，第一輪均無目的片段擴(kuò)增，第二輪產(chǎn)物為206bp。62個(gè)卵裂胚胎中有6個(gè)檢測到特異性HBV mRNA片段，陽性檢出率為 9.7%(6/62)。女方HBV標(biāo)志物陽性、男方HBV標(biāo)志物陽性和夫妻雙方HBV標(biāo)志物陽性的卵裂胚胎陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)，用Fisher確切概率法分析，各組間陽性率差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.468)，見附表。

附表　各組受精卵中HBV陽性率比較

用Fisher確切概率法分析，各組間受精卵中檢出HBV陽性率的比較差異χ2= 1.519，P>0.05，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14例女方HBV標(biāo)志物陽性卵裂胚胎中，2例卵裂胚胎中HBV mRNA陽性,陽性率為14.3%(2/14)；其中1例的5個(gè)胚胎中有3個(gè)陽性信號，另1例3個(gè)卵裂胚胎中檢出2個(gè)陽性信號。9例男方HBV標(biāo)志物陽性的卵裂胚胎中的陽性率為11.1%(1/9)，此例的4個(gè)胚胎中檢出1個(gè)陽性信號。陰性對照的胚胎中未檢出特異性HBV mRNA信號(圖2)。

圖2　單個(gè)卵裂胚胎HBV mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

用巢式PCR擴(kuò)增出目的片段，第一輪均無目的片段擴(kuò)增，第二輪產(chǎn)物為206bp。上圖為女方乙肝陽性組，其中一例的5個(gè)胚胎中有3個(gè)陽性信號，另1例3個(gè)卵裂胚胎中檢出2個(gè)陽性信號。下圖顯示1例男方HBV標(biāo)志物陽性的4個(gè)胚胎中檢出1個(gè)陽性信號。

討論

我們在卵巢組織及卵母細(xì)胞內(nèi)檢測到HBV復(fù)制的指標(biāo)，包括HBcAg、HBV DNA和HBV mRNA，這些都為HBV隨著受精進(jìn)入胚胎并具有活躍復(fù)制提供基礎(chǔ)。有學(xué)者將HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠卵細(xì)胞后與正常精子受精或直接轉(zhuǎn)染入受精卵內(nèi)，在子代小鼠中不僅觀察到了整合的HBV DNA片段[6]，還發(fā)現(xiàn)了HBV復(fù)制和表達(dá)的證據(jù)，更有甚者還發(fā)現(xiàn)了3.5 kb mRNA和少量包裝在Dane顆粒中的部分雙鏈DNA[7]。這些研究說明HBV可進(jìn)入動物卵母細(xì)胞，而這些含有HBV的卵母細(xì)胞并不被選擇性淘汰而成功受精，并在母體內(nèi)發(fā)育成熟產(chǎn)生新的子代個(gè)體。HBV不僅能在新子代個(gè)體基因內(nèi)整合，更有甚者，在HBV會在其內(nèi)復(fù)制和表達(dá)，最終造成轉(zhuǎn)基因動物的HBV母嬰垂直傳播。但是由于HBV具有嚴(yán)格的種屬特異性，且轉(zhuǎn)基因過程與自然感染有很大差距，因此以上研究與自然過程發(fā)生的人類經(jīng)卵細(xì)胞HBV母嬰傳播有著很大的差距。由于人類的卵母細(xì)胞不易獲得，研究人類的HBV經(jīng)卵細(xì)胞傳播途徑進(jìn)展緩慢。有報(bào)道指出HBV DNA在人類卵母細(xì)胞基因組內(nèi)存在整合；人類生殖細(xì)胞攜帶的HBV DNA能夠通過受精的方式垂直傳遞給早期胚胎。但是僅僅是以整合狀態(tài)存在的遺傳傳遞并不意味著胚胎必定會感染HBV，只有發(fā)現(xiàn)具有完整復(fù)制活性的病毒才是真正意義的母嬰傳播。

我們通過單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)，檢測到了在早期卵裂細(xì)胞中存在HBV mRNA且結(jié)果顯示女方HBV標(biāo)志物陽性組、男方HBV標(biāo)志物陽性組和夫妻雙方HBV標(biāo)志物陽性組的早期卵裂胚胎中HBV mRNA的陽性檢出率分別為13.2%(5/38)、5.6%(1/18)和0%(0/6)，且各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究在人類早期胚胎中檢測出了HBV mRNA，說明胚胎中感染的HBV不僅僅是以整合狀態(tài)存在，還具有一定的復(fù)制活性，在一定的條件下可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。由于所有受試人員來自體外受精人群，在取卵過程中盡量避免了血液污染并進(jìn)行了充分的清洗，胚胎中所含HBV應(yīng)該來自于生殖細(xì)胞本身，同時(shí)我們之前通過原位雜交在卵母細(xì)胞中也檢出的HBV mRNA，因此，有理由相信卵母細(xì)胞中活躍復(fù)制的HBV可以隨著受精過程進(jìn)入受精卵并在胚胎內(nèi)也可以復(fù)制，發(fā)生真正意義上的HBV經(jīng)卵細(xì)胞母嬰垂直傳播。遺憾的是，我們并沒有檢測受精前的生殖細(xì)胞中的HBV，不能證實(shí)在早期胚胎中的檢出的HBV直接來自這些生殖細(xì)胞。這是由于所有患者要求的將取出的生殖細(xì)胞(精子和卵子)進(jìn)行體外受精以確保受精成功率。

我們對所有逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都進(jìn)行了管家基因β-actin的擴(kuò)增，結(jié)果顯示均擴(kuò)增出了目的片段，其意義在于表明所有標(biāo)本的mRNA均被成功逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，以排除因?qū)嶒?yàn)問題導(dǎo)致的假陰性的可能性。同時(shí)設(shè)置了逆轉(zhuǎn)錄和PCR時(shí)的陰性對照以排除實(shí)驗(yàn)本身引起的假陽性。

總之，通過選擇患有慢性乙肝并進(jìn)行體外受精的這一特殊人群，我們證實(shí)了在早期卵裂胚胎內(nèi)存在的HBV具有復(fù)制活性使胚胎感染HBV，發(fā)生真正意義上的經(jīng)卵細(xì)胞途徑的HBV母嬰垂直傳播。

參考文獻(xiàn)

[1]Feng Y, Ya-Fei Yue, Shu-Hong Li,etal. Presence of HBsAg, HBcAg and HBVDNA in Ovary and ovum of the Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection [J]. Am J Obstet Gynecol, 2006, 193(2): 387-392.

[2]Wang AH, Wang AQ, Xu DZ,etal. The mechanism of HBV infection of human trophoblast cell[J]. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Za Zhi, 2008, 22: 51-53.

[3]金燕，邱婷，呂頤菲，等. HBV在卵巢組織及卵細(xì)胞中的復(fù)制情況的研究.[J]．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2015，44(7)：17--20．

[4]Barone M, Spano D, D'Apolito M,etal. Gene expression analysis in HBV transgenic mouse liver: A model to study early events related to hepatocarcinogenesis [J]. Mol Med, 2006, 12(4-6): 115-123.

[5]Cabrerizo M, Bartolomé J, Caramelo C,etal. Molecular analysis of hepatitis B virus DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells from hepatitis B surface antigen-negative cases [J]. Hepatology, 2000, 32(1): 116-123.

[6]Chen LZ, Fan XG, Gao JM. Detection of HBsAg, HBcAg, and HBV DNA in ovarian tissues from patients with HBV infection [J]. World J Gastroenterol，2005, 11: 5565-5567.

[7]Bagis H, Arat S, Merean HO,etal. Stable transmission and expression of the Hepatitis B virus total genome in hybridtransgenie miee until F10 generation [J]. J Exp Zoolog A Comp Exp Biol, 2006, 305(5): 420-427.

(收稿：2015-06-09)

【中圖分類號】R392.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.005