三種方法檢測兒童肺泡灌洗液中結核分枝桿菌結果分析

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(1.河北省兒童醫院　呼吸二科，河北　石家莊　050000；2.河北省胸科醫院　二病區，河北　石家莊　050000)

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三種方法檢測兒童肺泡灌洗液中結核分枝桿菌結果分析

牛波1，劉建華1，曹麗潔1，帥金鳳1，劉新鋒1，池躍朋2

(1.河北省兒童醫院呼吸二科，河北石家莊050000；2.河北省胸科醫院二病區，河北石家莊050000)

【摘要】目的：探討直接涂片法、離心涂片法和玻片沉淀法三種抗酸染色技術檢測兒童肺泡灌洗液中結核分枝桿菌對于活動性肺結核的診斷價值。方法：對40例疑似肺結核患兒的肺泡灌洗液標本同時進行直接涂片法、離心涂片法和玻片沉淀法檢測抗酸桿菌，比較三種方法的陽性率。結果：直接涂片法、離心涂片法和玻片沉淀法陽性率分別為12.5%(5/40)、30.0%(12/40)、77.5%(31/40)，與直接涂片法及離心涂片法比較，玻片沉淀法的陽性率較高，差異有統計學意義(配對χ2=24.04，P<0.001；配對χ2=15.43，P<0.001)；直接涂片法和離心涂片法比較，差異有統計學意義(配對χ2=5.14，P<0.05)。結論：三種方法中，玻片沉淀法陽性率最高，它是一種快速、簡便，經濟的檢驗技術，值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】肺泡灌洗液；肺結核；兒童

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.012

隨著全球結核病發病率的上升，兒童結核病也隨之增加，據世界衛生組織報道，2013年，全球有900百萬人罹患結核病，約55萬例為兒童。在中國，卡介苗接種率雖然很高，但每年仍約有100萬新發病例，兒童感染率約為0.5%～2%。由于兒童肺結核臨床表現和體征不典型，痰標本難得，致使不易取得病原學證據，誤診誤治情況十分常見。在2012年8月～2014年12月期間，我院共對40例疑似肺結核患兒進行了纖維支氣管鏡檢查，同時進行肺泡灌洗，分別用直接涂片法、離心涂片法和玻片沉淀法對灌洗液進行抗酸染色檢測，以了解不同技術對兒童肺結核診斷的效率，探討玻片沉淀抗酸染色法對兒童肺結核的診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料病例來源于河北省兒童醫院，2012年8月～2014年12月共40例疑似肺結核患兒經篩選入組，男性26例，女性14例，年齡1～12歲，其中1～3歲6例，3～5歲12例，5～12歲22例。入組病例的診斷均符合中華醫學會兒科分會制定的兒童肺結核臨床診斷標準，且行纖維支氣管鏡檢查前，三次痰涂片抗酸染色陰性或無痰，但胸部X線提示有活動性肺結核特征。所有病例均符合兒科支氣管鏡術指南的檢查適應證，檢查前患兒家屬均簽署了知情同意書。

1.2臨床表現和體征40例患兒中，咳嗽33例(24例為刺激性干咳，9例為痙攣性咳嗽)，22例為不規則發熱，16例為低熱，2例為中高熱，盜汗10例，乏力、消瘦13例，呼吸困難3例，胸痛2例，痰中帶血絲1例；肺部體征無明顯異常者13例，有干濕啰音者17例，呼吸音弱者7例，叩診呈濁音者3例。

1.3影像學檢查40例患兒胸部X線平片檢查：雙肺粟粒狀影1例，左上肺空洞形成1例，左肺上葉浸潤病灶5例，右肺上葉浸潤病灶2例，少量胸腔積液3例。X線平片無明顯異常的28例患者，行胸部CT檢查：有小斑片浸潤影、纖維條索狀影10例，縱隔淋巴結和(或)肺門淋巴結腫大11例，左肺上葉高密度影并縱隔淋巴結腫大6例，無明顯異常1例。

1.4儀器檢查采用Olympus P260F纖維支氣管鏡檢查。7歲以下的兒童采用異丙酚靜脈復合麻醉，7歲以上兒童采用利多卡因氣管內黏膜表面麻醉?；純喝⊙雠P位，纖維支氣管鏡經鼻腔進入，仔細檢查聲門、氣管、隆突、各肺段支氣管黏膜病變情況，對影像學確定的病灶部位重點檢查，然后經導管注入適量生理鹽水，收集灌洗液。

1.5儀器及材料玻片離心沉淀儀(Thermo Cytospin4型)；低溫離心機；抗酸染色液等。

1.6檢測方法

1.6.1直接涂片法取混勻的灌洗液直接涂布在玻片上，大小為1cm×2cm，固定后，滴加石炭酸復紅染液，染色10～15 min，3%鹽酸酒精脫色1 min，美藍復染0.5～1 min，水沖洗后自然干燥，然后用油鏡檢查。詳細過程參照《痰涂片鏡檢質量保證手冊》。

1.6.2離心涂片法取2 mL灌洗液加入一次性試管中，以3000 r/min在4℃下離心15 min，用吸管輕輕吸取上清液棄掉，混勻試管底部沉渣進行涂片，涂布面積1cm×2cm。然后行抗酸染色及鏡檢。

1.6.3玻片沉淀法將1 mL灌洗液與2 mL 4%氫氧化鈉在漩渦振蕩器上充分混勻，取0.5 mL混合液加入玻片離心沉淀儀中，以450 r/min離心5 min，取出玻片干燥后進行抗酸染色及鏡檢。

1.7統計學處理分別計算3種方法的陽性率，采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析，3種方法間的比較采用兩兩配對卡方檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

40例灌洗液標本中，玻片沉淀法陽性31例，陽性率77.5%，直接涂片法陽性5例，陽性率12.5%，玻片沉淀法明顯高于直接涂片法，差異有統計學意義(配對χ2=24.04，P<0.001，表1)；離心涂片法陽性12例，陽性率30.0%，玻片沉淀法明顯高于離心涂片法，差異有統計學意義(χ2=15.43，P <0.001，表2)；直接涂片法陽性率低于離心涂片法，差異有統計學意義(χ2=5.14，P<0.05，表3)。

表1玻片沉淀法與直接涂片法檢測結果比較

玻片沉淀法直接涂片法+-合計+52631-099合計53540

配對χ2=24.04，P<0.001。

表2玻片沉淀法與離心涂片法檢測結果比較

玻片沉淀法離心涂片法+-合計+112031-189合計122840

配對χ2=15.43，P<0.001。

表3直接涂片法與離心涂片法檢測結果比較

直接涂片法離心涂片法+-合計+505-72835合計122840

配對χ2=5.14，P<0.05。

3討論

我國結核病人數居世界第二位，僅次于印度。隨著多重耐藥菌株的出現、艾滋病等免疫缺陷患者的增多、人口流動頻繁以及治療預防體系不完善，結核病疫情不容樂觀。兒童肺結核病在我國屬于常見病、多發病，臨床診斷主要根據癥狀、體征、影像學、PPD試驗、結核病接觸史等。但是由于缺乏典型的癥狀、體征，極易誤診為呼吸道感染，所以兒童肺結核的早期實驗室診斷尤為重要。痰涂片抗酸染色或痰結核分枝桿菌(結核菌)培養陽性是診斷結核病的“金標準”，但是涂片的敏感性低，培養所需時間長，一般在2～8周才能獲得結果[10]。很多患兒取得痰標本十分困難，纖維支氣管鏡檢查技術，不僅可以直接觀察病變部位，還解決了標本采集的問題，通過肺泡灌洗可以得到標本，然后再通過其他技術進行檢測，明顯提高了診斷效率。灌洗液的檢測方面，近些年應用的PCR技術，雖然提高了陽性率，但是對實驗室的條件要求高，假陽性問題難以解決；GENE Xpert技術陽性率高，但是儀器昂貴，收費高，在中國還未普遍應用。雖然抗酸染色陽性率不高，但其以經濟、簡便、快速的優勢仍在全國普遍應用，如何在抗酸染色方面進行進一步的應用研究很少有人關注。玻片離心沉淀儀以往主要應用于細胞收集方面，很少有研究者將此技術用于檢測結核分枝桿菌，Chen P等[11-12]把此技術應用到結核性腦膜炎的診斷方面，使得敏感度從傳統離心涂片法的3.3%提高到了82.9%。本研究將此技術應用到灌洗液方面，使得陽性率達到77.5%，遠高于直接涂片法的12.5%和離心涂片法的30.0%。

直接涂片、離心涂片抗酸染色法的檢出上限為5000～10 000條/mL結核菌，雖然涂布面積為1cm×2cm(10 000個視野)，但是只檢測300個視野，陽性率不高。離心涂片法雖然起到了一定的濃集效果，但是由于結核菌的密度小于水，很難通過高速離心使結核菌完全沉淀下來，在棄掉上清和轉移涂片的過程中會造成結核菌的丟失。玻片沉淀法在離心的過程中，液體成分被濾紙吸收，結核菌直接沉淀到玻片上，不涉及浮力的影響以及轉移損失的問題，并且涂布面積小(直徑6 mm),達到了高度濃縮的目的，所以檢出率得以明顯提高，其設備簡單，30 min即可出結果，明顯優于傳統直接涂片法和離心涂片法。綜上所述，玻片沉淀法快速、簡便、經濟、診斷兒童肺結核陽性率高，對于早期診斷意義重大，值得結核病相關單位推廣應用。

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Outcomes of detecting the Mycobacterium tuberculosis in the bronchoalveolar lavage fluid from children by three different acid-fast staining

NIU Bo,LIU Jianhua,CAO Lijie,SHUAI Jinfeng,LIU Xinfeng,CHI Yuepeng

No.2 Department of Respiratory Diseases,Hebei Provincial Children′s Hospital,Shijiazhuang 050000,China

【Abstract】Objective：To assess the diagnostic value of applying conventional smear,centrifugal smear and cytospin slides technique to detecting the Mycobacterium tuberculosis in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF)for diagnosis of pulmonary tuberculosis in children.Methods:The BALF samples were obtained from 40 children suspected with tuberculosis,and detected by technique of direct smear,centrifugal smear and cytospin slides,respectively.Then the positive rate was compared among the three techniques.Results:The positive rate was 12.5%(5/40),30.0%(12/40)and 77.5%(31/40)for direct smear,centrifugal smear and cytospin slides,respectively.Cytospin slide method demonstrated higher positive rate than the other two(χ2=24.04,P<0.001;χ2=15.43,P<0.001),and the difference was significant between direct smear and centrifugal smear method as well(χ2=5.14,P<0.05).Conclusion:Of the three laboratory studies for Mycobacterium tuberculosis in BALF from children,cytospin slide test may demonstrate highest positive rate,and is worthy of wider clinical recommendation because of its quick and simple process as well as low testing cost.

【Keywords】bronchoalveolar lavage fluid;pulmonary tuberculosis;children

文章編號：·臨床醫學·1002-0217(2016)01-0041-03

基金項目:河北省衛生廳重點科技研究計劃(20130397)

收稿日期：2015-06-14

作者簡介：牛波(1978-)，女，主治醫師，(電話)13833132393，(電子信箱)24201475@qq.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 725.6A

池躍朋，男，主治醫師，(電子信箱)chiyuepeng2013@163.com，通訊作者.