灰巖金線蓮種子萌發與組培快繁技術研究

胡琦敏 黃云峰 張啟偉

摘要：【目的】利用灰巖金線蓮種子無菌播種進行組培苗生產，為其工廠化組培育苗提供參考。【方法】采用灰巖金線蓮種子為外植體，以MS或1/2MS為基本培養基，探討不同激素組合對外植體進行無菌播種、原球莖增殖、叢生芽分化及生根壯苗的影響。【結果】采用0.1%升汞處理灰巖金線蓮蒴果20 min，滅菌率可達100%，且種子萌發不受影響。在種子萌發培養基中添加香蕉泥有利于種子萌發，最適合種子萌發的培養基為1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥；在原球莖增殖培養中，低濃度的6-BA和NAA有利于灰巖金線蓮原球莖增殖，最適合原球莖增殖的培養基為1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥；叢生芽分化的最適培養為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥+0.1%活性炭，原球莖分化叢生芽較多，生長勢最佳；最適合灰巖金線蓮生根壯苗的培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥+0.1%活性炭。【結論】利用灰巖金線蓮種子進行無菌播種，通過原球莖增殖和分化，可獲得大量優質組培苗，是實現工廠化育苗的理想途徑。

關鍵詞： 灰巖金線蓮；無菌播種；原球莖增殖；叢生芽

中圖分類號： S567.19 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1891-06

Abstract：【Objective】In order to provide references for industrializing production of tissue-cultured seedlings of Anoectochilus calcareus Aver.， tissue-cultured seedlings of A. calcareus were obtained by axenic sowing in vitro. 【Method】With A. calcareus seeds as explants， MS or 1/2MS as basic culture medium， effects of different hormone combinations on aseptic sowing， protocorm proliferation， multiple shoot differentiation，promoting growth and rooting were studied. 【Result】Results showed that， 0.1% mercuric-chloride for 20 min showed better disinfection effect on A. calcareus capsule，with 100% of disinfection rate， and the seed germination was not affected. Adding banana puree to medium benefited seed germination. The optimal medium for seed germination was 1/2MS+6-0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L banana puree. In proliferation culture of protocorm， low concentration of 6-BA and NAA was beneficial to protocorm proliferation. The optimal medium for protocorm proliferation was 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L banana puree. The optimal medium for multiple shoots differentiation was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L banana puree+0.1% activated carbon， protocorm could differentiate into more multiple shoots， showing growth vigor. The optimal medium for promoting growth and rooting of seedlings was MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+60 g/L banana puree+0.1% activated carbon. 【Conclusion】A lot of high-quality tissue-cultured seedlings of A. calcareus can be obtained by aseptic sowing， proliferation and differentiation of protocorm. Therefore， aseptic sowing is ideal way to realize industrial production of A. calcareus seedlings.

Key words： Anoectochilus calcareus Aver.； aseptic sowing； protocorm proliferation； multiple shoot

0 引言

【研究意義】灰巖金線蓮（Anoectochilus calcareus Aver.）為蘭科（Orchidaceae）金線蘭屬（Anoectochilus）多年生草本植物，是金線蓮藥材的植物來源之一。金線蘭屬植物在民間為珍稀名貴中藥材，通稱金線蓮（金效華等，2002；陳謙海，2004），民間多用于治療糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病（福建中醫藥研究所，1982），素有“藥王”、“金草”之稱，市場需求量大。灰巖金線蓮與其他當前種植的金線蓮藥用功效相似，且其植株大，產量高，是精品藥材的優勢種。但金線蓮屬種子在自然環境下極難萌發，野生資源較少，因此，人工種植是對金線蓮種質資源保護及緩解供需矛盾的必要手段，而采用組織培養技術進行工廠化育苗，對灰巖金線蓮資源的保護和開發利用具有重要意義。【前人研究進展】灰巖金線蓮最先發現于越南，目前國內外對該種的研究較少，但近年來對金線蘭屬其他植物的組織培養研究相對較多。金線蓮多以種子、莖段、莖尖為外植體，通過無菌播種、原球莖增殖、不定芽或叢生芽誘導、生根壯苗等階段實現金線蓮的組培快繁。在種子萌發、不定芽誘導及繼代增殖培養基的選擇上，伍成厚等（2008）利用1/2MS為基本培養基，添加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA，播種45 d左右金線蓮種子可發育成原球莖；羅慶國等（2011）以金線蓮植株莖段為外植體，在基本培養基中添加不同濃度的植物生長調節劑，結果表明，不定芽誘導與繼代增殖較適宜的培養基分別為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；羅安雄等（2012）利用1/2MS、MS、N6、KC、Harvais和Fast等6種培養基對福建金線蓮進行種子萌發試驗，結果發現在MS培養基中的萌發率最高。在外植體的選擇方面，祁永瓊等（2014）以金線蓮頂芽、中部莖段、基部莖段為外植體進行對比試驗，結果發現以頂芽為外植體時的誘導率、增殖倍數最高。在不定芽和叢生芽的誘導研究方面，李梅等（2005）在誘導臺灣金線蓮叢生芽時發現，叢生芽增殖倍數隨著6-BA濃度的升高而增高，添加NAA有利于叢生芽的誘導和分化，當添加6-BA 5.0 mg/L和NAA 1.0 mg/L時，叢生芽多且較粗壯；羅慶國等（2011）也發現較高濃度的6-BA更有利于金線蓮叢生芽的繼代增殖。在生根壯苗研究方面，不同品種添加不同的添加物及濃度對生根壯苗的影響不同。李梅等（2005）發現在臺灣金線蓮生根壯苗培養時添加2%活性炭和150 g/L香蕉汁有利于生根；而羅慶國等（2011）認為在金線蓮生根壯苗培養基中加入20 g/L香蕉泥生根效果最佳。【本研究切入點】金線蘭屬植物野生資源日漸減少，組織培養是實現大面積人工種植的必要手段。灰巖金線蓮為我國新記錄種，但國內有關灰巖金線蓮組織培養快速繁育的研究尚無文獻報道。【擬解決的關鍵問題】利用灰巖金線蓮種子為外植體，采用不同的滅菌方法和激素組合等進行組織培養快速繁育研究，以期獲得快速、高效的金線蓮組培苗生產技術，為灰巖金線蓮的工廠化育苗提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為灰巖金線蓮成熟蒴果內種子，采自廣西那坡縣。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 外植體滅菌 將成熟未開裂的灰巖金線蓮蒴果用自來水沖洗表面塵土30 min，用洗潔精清洗蒴果表面后置于超凈工作臺上，用75%酒精浸泡30 s，然后隨機分成兩組：一組材料用10%次氯酸鈉加兩滴吐溫-20，浸泡20或25 min，無菌水沖洗4～5次；另一組材料用0.1%升汞加兩滴吐溫-20，浸泡10或20 min，無菌水沖洗4～5次。以上處理以250 mL燒瓶為容器，每組浸泡5個蒴果，浸泡液以沒過蒴果但不超過燒瓶的1/3容量為宜。以上處理組的種子接種于1/2MS培養基中，每處理組接種10瓶。統計污染率。

1. 2. 2 種子萌發 在培養皿中將滅菌灰巖金線蓮蒴果切開，將種子均勻播種于培養基中，暗培養兩周，再轉到光照培養。種子萌發基本培養基為1/2MS培養基，在培養基中添加不同濃度的6-BA（0.5、0.8、1.0 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）、6-BA（1.5、2.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L），以上組合添加香蕉泥（0和60 g/L），共10個處理，每處理組接種5瓶。觀察種子的萌發情況。萌發率的統計以在顯微鏡下取不同視野統計100粒種子中的萌發粒，萌發以胚突破種皮形成原球莖為準。

1. 2. 3 原球莖增殖 將萌發的原球莖塊切成大小約0.3 cm的塊狀，接種于原球莖增殖培養基中。以1/2MS培養基為基本培養基，添加60 g/L香蕉泥，比較不同濃度的6-BA（0.2、0.5、0.8、1.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L）（共8個處理）對原球莖增殖的影響，每處理組接種5個原球莖塊，觀察原球莖的增殖情況。原球莖的增殖率統計以測量增殖的原球莖塊大小為準。

1. 2. 4 叢生芽分化 將0.4 cm大小的原球莖塊接種于叢生芽分化培養基中，以MS培養基為基本培養基，添加60 g/L香蕉泥、0.1%活性炭，比較不同濃度的6-BA（1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0 mg/L）（共8個處理）對叢生芽分化的影響，每處理組接種5個原球莖塊，觀察芽的誘導情況，統計分化的叢生芽苗數。

1. 2. 5 生根壯苗 當叢生芽長至4～5 cm時分成單株，轉接到生根壯苗培養基中，以MS培養基為基本培養基，添加60 g/L香蕉泥、0.1%活性炭，比較不同濃度的6-BA（0、0.5 mg/L）和NAA（0、0.5、1.0、2.0 mg/L）（共8個處理）對生根壯苗的影響，每處理組接種5個芽，觀察苗的生長情況及生根情況，50 d后將小苗移出培養瓶統計生根條數。

培養條件：MS培養基添加3%蔗糖、7 g/L瓊脂；1/2MS培養基添加2%蔗糖、7 g/L瓊脂；培養室溫度（25±2）℃，光照強度1000～1200 lx，無菌播種后先暗培養7 d，然后轉到光照培養，種子萌發、原球莖增殖、叢生芽分化培養每天光照12 h，生根壯苗培養每天光照14 h。

1. 3 統計分析

試驗數據采用Excel 2007和SPSS 13.0進行整理和統計分析。

2 結果與分析

2. 1 不同滅菌方法對外植體污染率的影響

從表1可看出，外植體經10%次氯酸鈉處理20或25 min，8 d后種子100%污染；0.1%升汞處理10 min，7 d后種子100%污染，但0.1%升汞處理20 min的滅菌率可達100%，且種子萌發的原球莖生長良好，萌發率最高。因此，最適合灰巖金線蓮蒴果的滅菌方法是0.1%升汞浸泡20 min。

2. 2 不同激素水平及添加物對種子萌發的影響

將灰巖金線蓮種子撒播在添加6-BA和NAA的培養基表面，每隔5 d觀察1次，結果見表2。播種后20 d，6～8號培養基中的種子開始萌發膨大成白色原球莖；播種后60 d，1、3、6號培養基的種子萌發率均在99.0%以上，而5號培養基的萌發率僅為65.0%，說明較低濃度的6-BA有利于種子萌發。當6-BA濃度達1.5 mg/L、NAA濃度達0.5 mg/L時，種子萌發率開始降低；雖然1、3、6號培養基的種子萌發率差異不顯著（P>0.05，下同），但在相同的激素水平條件下，添加香蕉泥培養基中的種子提前萌發，且原球莖較大（圖1）。因此，最適合灰巖金線蓮種子萌發的培養基為：1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥。

2. 3 不同激素水平對原球莖增殖的影響

將萌發的原球莖塊接種到原球莖增殖培養基中，60 d后統計增殖倍數。從表3可看出，隨著6-BA濃度的增加，原球莖增殖倍數降低；當NAA濃度為0.5 mg/L時，增殖倍數明顯低于濃度為0.2 mg/L時，說明低濃度的6-BA和NAA有利于灰巖金線蓮原球莖增殖；當6-BA和NAA濃度增加時，原球莖會有少量芽分化。雖然1、2號培養基中的原球莖增殖倍數差異不顯著，但1號培養基6-BA的用量較少，可節約成本，因此，最適合灰巖金線蓮原球莖增殖的培養基為：1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥。

2. 4 不同激素水平對叢生芽分化的影響

將原球莖塊接種于叢生芽分化培養基中，60 d后統計分化的叢生芽數量。由表4可知，在不同激素水平配比條件下，灰巖金線蓮的叢生芽分化數量存在明顯差異。6-BA濃度為1.0～2.0 mg/L時，在6-BA濃度相同、NAA濃度不同的情況下，分化的叢生芽數差異顯著（P<0.05，下同），NAA濃度越高越不利于叢生芽分化；當6-BA濃度為3.0 mg/L時，雖然NAA濃度不同，但分化的叢生芽數差異不顯著。當NAA濃度為1.0 mg/L時，5、6、7號培養基中分化的叢生芽數差異不顯著；當NAA濃度為0.5 mg/L時，1、3號培養基分化的叢生芽數最多，差異不顯著，但3號培養基中叢生芽的長勢最好，芽粗壯，葉綠且較大。因此，最適合灰巖金線蓮原球莖分化叢生芽的培養基為：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥+0.1%活性炭，在該培養基下原球莖分化叢生芽較多，生長勢最佳（圖2）。

2. 5 不同激素水平對生根壯苗的影響

將灰巖金線蓮叢生芽分成單株接種于生根培養基上，接種50 d后統計生根數量并觀察苗生長情況。從表5可看出，灰巖金線蓮組培苗生根數均隨NAA濃度的增加而增加，當NAA濃度達2.0 mg/L、6-BA濃度為0.5 mg/L時生根數量最多（5.0±0.63條），與其他濃度處理組間差異顯著，且苗生長健壯，莖粗，葉片大（圖3）。因此，最適合灰巖金線蓮生根壯苗的培養基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+60 g/L香蕉泥+

0.1%活性炭。

3 討論

本研究對灰巖金線蓮蒴果滅菌時進行次氯酸鈉和升汞滅菌對比試驗，發現升汞較長時間的滅菌效果最佳，種子萌發率達100%。伍成厚等（2008）和黃勇（2010）利用0.1%升汞對金線蓮果實的滅菌時間為10 min，而本研究效果最佳的滅菌時間為20 min，其原因可能是本研究試驗材料直接從野外采回，果實表面帶有的菌群較多，也可能由于果實表面凸凹不平而導致滅菌時間加長。一般的金線蓮組培外植體材料（莖段）升汞滅菌時間為10～18 min（羅慶國等，2011；祁永瓊等，2014），長時間滅菌會影響外植體的存活率，但金線蓮未開裂蒴果有果皮保護，因此本研究中升汞滅菌20 min對灰巖金線蓮種子的萌發無影響。

香蕉汁、椰乳等天然提取物在蘭科植物組培中較常用，如曾宋君等（2004）認為在培養基中添加椰乳能促進白芨種子的萌發與成苗；張鐵等（2006）在滇越金線蓮種子萌發培養基中添加椰乳，不僅可以提高種子萌發率，而且原球莖分化的苗生長健壯。本研究在種子萌發培養基中添加香蕉泥可使灰巖金線蓮種子的萌發時間提前，使原球莖生長健壯，有利于原球莖的增殖及分化。但不同天然提取物在蘭科植物組培的各階段有不同作用。王建明等（2013）發現，添加香蕉泥對金線蓮芽苗的增殖及壯苗有促進作用，而添加椰子汁雖然對金線蓮芽苗的增殖效果較好，但對壯苗效果較差。

本研究發現低濃度的6-BA和NAA有利于灰巖金線蓮原球莖的增殖，與伍成厚等（2008）的研究結果相似，即金線蓮原球莖增殖率最高的激素配比為0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。在金線蓮叢生芽誘導的研究中，前人研究較多的是從莖段腋芽萌發新芽后再誘導叢生芽（羅慶國等，2011），也有利用莖節誘導類原球莖的報道，雖然從原球莖分化叢生芽的增殖倍數較大且從原料數量上也占有優勢，但有關的報道較少。羅曉青等（2014）利用MS和1/2MS培養基對興仁金線蓮進行種子播種對比試驗，發現1/2MS培養基上的原球莖能較早分化成叢生芽，但未進行激素配比對比試驗。本研究通過不同濃度的6-BA和NAA配比研究，發現較高濃度的6-BA與較低濃度的NAA配比有利于灰巖金線蓮原球莖分化叢生芽，且分化的叢生芽數量多而健壯。

組培苗生長健壯，根系發達，移栽后可提高其對外界環境的適應能力和抵抗力。本研究發現，在生根壯苗階段，高濃度的NAA有利于生根，與一定濃度的6-BA配合使用，可使幼苗生長健壯，葉片大，提高移栽存活率。在NAA的使用濃度方面，本研究NAA的使用濃度為2.0 mg/L，趙玥和郭順星（2011）在福建金線蓮生根培養階段使用的濃度為3.0 mg/L，但申剛等（2015）認為不同濃度的NAA對金線蓮生根數影響的差異不顯著。在生根壯苗階段，不同產地的同種植物或同屬植物對激素的需求量不同可能是由于不同植物之間所含的內源激素不同所致。

4 結論

本研究結果表明，利用灰巖金線蓮種子進行無菌播種，通過原球莖增殖和分化，可獲得大量優質組培苗，是實現工廠化育苗的理想途徑。

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（責任編輯 麻小燕）