人結(jié)直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測(cè)方法

摘要：為了探討人結(jié)直腸癌BRAF基因V600E突變的檢測(cè)方法，文章通過(guò)等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)80例結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本的BRAFV600E突變性，且與Sanger測(cè)序法進(jìn)行對(duì)比，得出結(jié)論：通過(guò)等位基因PCR技術(shù)檢測(cè)人結(jié)直腸癌BRAF基因V600E突變，與測(cè)序法對(duì)比靈敏度、簡(jiǎn)便性、快速性更高，對(duì)人腫瘤BRAFV600E突變具有較高的篩查價(jià)值。

關(guān)鍵詞：人結(jié)直腸癌；等位基因；特異性擴(kuò)增；BRAF基因；V600E突變 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R735 文章編號(hào)：1009-2374（2016）24-0072-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.24.036

目前，臨床中有超過(guò)30種BRAF突變類型，大約90%突變處在第15外顯子，而V600E突變則是最為常見(jiàn)的一種突變。本文將人BRAF基因V600E突變位點(diǎn)作為等位基因特異性擴(kuò)增引物，經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)且與金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法，分析其可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選用的人大腸癌SW480、HT29細(xì)胞均通過(guò)測(cè)序顯示為BRAF野生型、攜帶BRAFV600E雜合突變。80例結(jié)直腸癌標(biāo)本均由醫(yī)院病理科提供。其DNA腫瘤組織切片通過(guò)鏡檢顯示腫瘤細(xì)胞水平超過(guò)90%。

1.2 方法

提取DNA，并將模板DNA放置到-20℃環(huán)境內(nèi)保存。等位基因特異性擴(kuò)增法：將人大腸癌細(xì)胞株SW480、HT29與80例腫瘤標(biāo)本予以等位基因特異性擴(kuò)增，PCR體系總體積是20μL ，含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有0.5μL（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達(dá)到20μL。通過(guò)95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s；67℃退火20s；72℃延伸30s，總45個(gè)循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)。將腫瘤標(biāo)本取出1μL進(jìn)行第一次擴(kuò)增，并將其產(chǎn)物用作二次擴(kuò)增物，采用同樣擴(kuò)增方法。將PCR產(chǎn)物采集5μL實(shí)施瓊脂糖（2%）凝膠電泳，持續(xù)30min，然后予以顯像。

標(biāo)本與細(xì)胞株均通過(guò)PCR測(cè)序且對(duì)比等位基因特異性擴(kuò)增的結(jié)果。PCR反應(yīng)條件為：含有Mg2+buffer2μL，dNTPmixture1.5μL，上、下游引物各有1μL（（10μmol），模板DNA30ng，置入滅菌去離子水達(dá)到20μL。通過(guò)95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s；54℃退火20s；72℃延伸30s，總40個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖（2%）凝膠電泳顯示目的條帶擴(kuò)增完成后進(jìn)行測(cè)序。

采集SW480、HT29細(xì)胞株DNA，通過(guò)核酸定量?jī)x進(jìn)行定量，達(dá)到30ng，依據(jù)一定比例通過(guò)攜帶BRAF野生型（SW480）的核酸與包含BRAFV600E突變（HT29）的核酸相混合，獲得包含50%、25%、12.5%、6.2%、3.1%、1.5%的突變DNA混合模板，然后再分別采集30ng實(shí)施等位基因特異性擴(kuò)增，且對(duì)比普通PCR后測(cè)序的靈敏度。

2 結(jié)果

BRAF基因V600E突變結(jié)果經(jīng)PCR條件反應(yīng)，能夠選擇擴(kuò)增出攜帶有BRAF基因V600E雜合突變的細(xì)胞株。80例大腸癌石蠟標(biāo)本中，6例形成目的擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)測(cè)序，74例BRAF基因15外顯子1799位核苷酸是野生型，6例為BRAF基因V600E突變，此結(jié)果與等位基因特異性擴(kuò)增具有一致性。經(jīng)等位基因特異性擴(kuò)增的不同比例突變核酸，此法可于6.2%突變基因模板內(nèi)擴(kuò)增目的條帶，BRAF基因V600E突變的敏感度可低到6.2%。普通PCR后測(cè)序結(jié)果自峰圖顯現(xiàn)50%、25%、12.5%的突變位點(diǎn)，比12.5%低的與背景信號(hào)相混雜難以測(cè)出。

3 討論

惡性腫瘤使得人類生命健康受到嚴(yán)重威脅，且有日益突出的趨勢(shì)，尋找較為有效的，可以在早期對(duì)其進(jìn)行診斷治療的方法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已逐漸成為較為重要的研究課題，是基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)項(xiàng)目。腫瘤細(xì)胞在基因組水平上與正常體細(xì)胞具有比較高的差異，是腫瘤演變及生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)穩(wěn)定復(fù)制的一類具有較高重要性的驅(qū)動(dòng)突變，可用作新的生物標(biāo)志物，對(duì)于腫瘤的臨床診斷與預(yù)后評(píng)判具有重要意義。

BRAF基因編碼蛋白是絲裂原活化蛋白激通路中旳一種絲蘇氨酸特異性激酶，是通路中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。目前BRAF基因檢測(cè)方法主要有探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）、測(cè)序法、高分辨率溶解曲線分析技術(shù)（HRM）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）和高效液相色譜法（DHPLC）等方法。BRAF基因V600E為此基因的熱點(diǎn)突變，表現(xiàn)是T變?yōu)锳，突變后使得編碼的谷氨酸被纈氦酸所代替。對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行靶向治療過(guò)程中顯示，攜帶有突變使得患者使用EGFR單抗藥物（西妥昔單抗、帕尼單抗）進(jìn)行治療時(shí)，無(wú)法達(dá)到較為理想的效果，而且對(duì)干預(yù)后不良是比較重要的一個(gè)標(biāo)志。在毛細(xì)胞白血病患者腫瘤細(xì)胞的測(cè)序中，腫瘤細(xì)胞全攜帶有突變，由此可知其極有可能是導(dǎo)致毛細(xì)胞白血病致病的一個(gè)重要機(jī)制，而且是此疾病的一個(gè)新型的特異性診斷標(biāo)志物，對(duì)于此疾病的靶向治療提供了一個(gè)新的方向。

BRAF基因突變對(duì)于評(píng)價(jià)惡性黑素瘤，預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌分子靶向藥物的臨床治療效果具有重要意義。對(duì)BRAF基因突變進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，篩選靶向藥物可以獲得益處的病例，對(duì)于制定理想方案具有重要意義，可有效節(jié)約成本，使得腫瘤病患達(dá)到個(gè)體化治療。但在臨床中，對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，腫瘤細(xì)胞具有較低的豐度，且有了大量野生型體細(xì)胞混在其中，對(duì)突變基因的準(zhǔn)確檢測(cè)具有明顯的不利影響。對(duì)BRAF基因進(jìn)行突變檢測(cè)具有多種方法，本文利用等位基因特異性擴(kuò)增檢測(cè)人結(jié)直腸癌BRAF基因V600E突變。

等位基因特異性擴(kuò)增在檢測(cè)已知突變時(shí)較為簡(jiǎn)便，通過(guò)Taq酶缺少3→5外切酶活性，引物3末端堿基與模板出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)，擴(kuò)增很難完成，由此可實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增定點(diǎn)突變或野生型基因的目的。在本文研究中，設(shè)計(jì)上游引物3端與BRAF基因V600E點(diǎn)突變進(jìn)行互補(bǔ)、與野生型堿基錯(cuò)配的上游引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增BRAFV600E突變。通過(guò)攜帶V600E突變的HT29細(xì)胞與BRAF野生型的SW480大腸癌細(xì)胞株的檢測(cè)，顯示此方法證實(shí)能夠測(cè)定出混雜在野生型內(nèi)的6.2%BRAF突變，與測(cè)序結(jié)果12.5%進(jìn)行對(duì)比，此法靈敏度更高。由于PCR的反應(yīng)體系體積通常比較低，當(dāng)使用傳統(tǒng)電極予以電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，需毫升級(jí)別的反應(yīng)體積，如此使得試劑內(nèi)損耗，增加成本，且導(dǎo)致檢測(cè)敏感性減弱。測(cè)序能夠?qū)A基位置形成直接定位且可辨別堿基具體類型，具有極高的直觀性與確定性，是突變檢測(cè)的一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”。Sanger測(cè)序法是DNA測(cè)序中比較經(jīng)典的一種方式，基本原理為雙脫氧鏈終止法，使用檢測(cè)標(biāo)記不同熒光素的DNA片段，然后經(jīng)詳細(xì)的數(shù)據(jù)計(jì)算獲得檢測(cè)的序列。但對(duì)于混合擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，因?yàn)樘幱谙嗤恢茫煌瑝A基所呈現(xiàn)的信號(hào)強(qiáng)度并無(wú)一致性，測(cè)序分析軟件在對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，便于獲得盡可能準(zhǔn)確的結(jié)果，如此在突變模板比例比較低時(shí)，測(cè)序系統(tǒng)通常會(huì)顯示突變信號(hào)峰是一種背景信號(hào)，使得此結(jié)果持續(xù)壓低。近些年來(lái)，此基因突變對(duì)于大腸癌、惡性黑素瘤的分子靶向藥物具有較高的治療效果預(yù)測(cè)作用，且此指標(biāo)逐漸得到人們的重視。因?yàn)榘邢蛩幬镌谑褂眠^(guò)程中，通常價(jià)格比較昂貴，而且具有較為顯著的毒副作用，所以采用具有較高準(zhǔn)確性、敏感性的指標(biāo)對(duì)治療效果的基因突變情況予以檢測(cè)并明確判定存在顯著指導(dǎo)意義。但是一部分晚期腫瘤患者在初診時(shí)錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療時(shí)機(jī)，對(duì)腫瘤源性的突變基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)只可使用穿刺組織活檢、胸腹水等方式。而且在臨床中通過(guò)測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)能夠防止假陰性的存在，通常不會(huì)收取腫瘤細(xì)胞水平小于50%的標(biāo)本，由此使得一些晚期腫瘤患者采用靶向治療時(shí)并無(wú)可以遵循的依據(jù)。通過(guò)本文的研究，檢測(cè)80例大腸癌石蠟標(biāo)本，測(cè)到6例，與PCR后測(cè)序結(jié)果具有一致性。建立突變富集ARMS熒光定量PCR法能夠檢測(cè)到101拷貝/反應(yīng)，顯示較高的靈敏性及分辨率，可于腫瘤樣本存在較少突變細(xì)胞時(shí)檢測(cè)到突變的等位基因，應(yīng)用前景良好。

總之，等位基因特異性擴(kuò)增能夠快速測(cè)到腫瘤BRAF基因V600E突變，與測(cè)序法進(jìn)行對(duì)比，此法不需特殊設(shè)備，簡(jiǎn)便性、快捷性、靈敏性、經(jīng)濟(jì)性高，值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：徐顯暑（1982-），男，浙江人，溫州因美生物科技有限公司副總經(jīng)理，碩士，研究方向：基因工程。

（責(zé)任編輯：王 波）