硒對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

劉　勇， 徐天嬌， 霍金蓮， 田永青, 李海榮， 曹向寧， 黃　瑞， 王偉偉(延安大學咸陽醫院老年病科，咸陽　7000；西安醫學院基礎醫學部藥理學研究室； 通訊作者，E-mail:xtj8@63.com)

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硒對人肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

劉勇1， 徐天嬌2*， 霍金蓮1， 田永青1, 李海榮1， 曹向寧1， 黃瑞1， 王偉偉1(1延安大學咸陽醫院老年病科，咸陽712000；2西安醫學院基礎醫學部藥理學研究室；*通訊作者，E-mail:xtj1118@163.com)

摘要：目的觀察硒對肺腺癌A549細胞增殖和凋亡的影響，探討硒誘導肺癌細胞凋亡的機制。方法設不同濃度硒(1,5,10 μmol/L)處理實驗組和一個陰性空白對照組，采用MTT法檢測細胞抑制率；FCM儀分析細胞的凋亡率；Western blot法檢測凋亡相關分子Bcl-2,Bcl-xL,Bax,細胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表達變化。結果與24 h組比較，同濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)硒處理48 h組和72 h組顯著抑制細胞增殖(P<0.05)，且具有時間依賴性；與同時間對照組比較，硒能夠明顯抑制細胞增殖(P<0.05)，且具有濃度依賴性。與對照組比較，硒能夠顯著性誘導細胞凋亡(P<0.05)，降低Bcl-2,Bcl-xL的表達并增加Bax,cytochrome C和caspase-3的表達(P<0.05)，且均具有濃度依賴性。結論硒通過調控Bcl-2，Bax，細胞色素C及caspase-3的表達誘導A549細胞凋亡。

關鍵詞：硒；肺腺癌;A549細胞；細胞凋亡

從腫瘤細胞學方面來說，肺癌的發生與細胞增殖及細胞凋亡之間的平衡被打破有關，凋亡過程受阻及惡性細胞無限增殖可導致肺癌發生。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中兩類典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白。這些因子的激活、過度表達或失活是腫瘤形成的重要機制。因此，通過調控這些凋亡相關蛋白的表達而誘導腫瘤細胞凋亡可能成為抗腫瘤治療最有效的途徑之一。

目前大多數研究表明硒具有防癌、抗癌作用[1-3]。硒對于不同腫瘤的作用效果和機制卻不盡相同，但誘導細胞凋亡是其發揮抗腫瘤作用的主要機制之一。本實驗以人肺癌A549細胞為研究對象，觀察不同濃度硒處理后細胞增殖和凋亡情況，并重點觀察與凋亡相關的重要分子Bcl-2、Bcl-xL、Bax細胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表達變化。深入探討硒可能通過線粒體途徑并依賴于caspase-3激活誘導A549細胞凋亡，為肺癌的研究提供更多實驗依據。

1材料與方法

1.1主要試劑

亞硒酸鈉、胰蛋白酶、牛血清白蛋白和NC膜購自美國Sigma公司；DMEM(高糖)、胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜(DMSO)購自上海生物化學試劑公司； BCA蛋白定量試劑購自美國Pierce公司；所有抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養

常規復蘇A549細胞，用含10% FBS(胎牛血清)、100 /ml 青霉素以及100 g/ml 鏈霉素的DMEM(高糖)培養液培養細胞，37 ℃、5%CO2恒溫箱中進行培養，間隔1-2 d換培養液1次。每2-3 d以0.25%胰酶消化，按1∶3傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3MTT法測定硒對A549細胞增殖的影響

取對數生長的細胞株分別以1.0×105/ml加入96孔板中培養24，48，72 h，實驗組設置不同濃度：1，5，10 μmol/L；空白組加入等體積的DMSO。在每孔加入MTT，作用4 h加入DMSO孵育30 min，在490 nm處測定吸光度。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

1.4流式細胞儀Annexin Ⅴ/PI雙染色法檢測細胞凋亡

取對數生長期的A549細胞，以不同濃度硒(1，5，10 μmol/L)培養72 h，收集細胞，調整細胞密度為1.0×106/ml，用Annexin Ⅴ/PI雙染色法處理，流式細胞儀檢測A549細胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測凋亡相關蛋白

取對數生長期的A549細胞，以不同濃度硒(1，5，10 μmol/L)培養72 h，消化細胞，離心，冰浴PBS洗3次。收集細胞，加入RIPA細胞裂解液、BCA法定量蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白電轉移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h；分別加一抗Bcl-2(1∶200)、Bcl-xL(1∶200)、Bax(1∶200)、細胞色素C(1∶200)、caspase-3(1∶200)及β-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜；洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1 h，充分洗滌后與ECL反應，即刻與X線片曝光，目的條帶使用分析儀進行分析。

1.6統計學分析

2結果

2.1硒對A549細胞增殖的影響

不同濃度硒(1，5,10 μmol/L)對A549細胞的增殖均具有抑制作用，且具有一定濃度依賴性(見表1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L兩個濃度的硒對A549細胞增殖抑制較明顯，與對照組及同一濃度不同時間組比較具有統計學差異(P<0.05)。

2.2硒對A549細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示：A549細胞經1，5，10 μmol/L硒處理48 h，細胞凋亡比例呈現濃度依賴性增加(見圖1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒處理組與對照組具有統計學差異(P<0.05)。

圖1　流式細胞術檢測不同濃度硒對A549細胞凋亡的影響Figure 1　Effects of selenium on apoptosis of A549 cells by FCM

組別24h48h72hODIR(%)ODIR(%)ODIR(%)對照組1.104±0.0100 1.113±0.03201.109±0.03401μmol/L組1.001±0.0439.30.984±0.02111.50.964±0.03113.15μmol/L組0.745±0.030*32.50.651±0.051**△41.50.533±0.062**△51.910μmol/L組0.643±0.041**41.80.427±0.037**△61.60.319±0.048**△71.2

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；同組與24 h比較，△P<0.05

2.3硒對A549細胞Bcl-2、Bcl-xL、Bax和細胞色素C表達的影響

1， 5,10 μmol/L硒作用于A549細胞48 h，硒能夠減少Bcl-2和Bcl-xL的表達，同時增加細胞中Bax、細胞色素C和caspase-3的表達，且均具有濃度依賴性(見圖2-6)。其中5 μmol/L and 10 μmol/L硒處理組與對照組有顯著性差異(P<0.05)。

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01 圖2　不同濃度硒對A549細胞Bcl-2表達的影響Figure 2　The effects of selenium on Bcl-2 expression in A549 cells

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3　不同濃度硒對A549細胞Bcl-xL表達的影響Figure 3　The effects of selenium on Bcl-xL expression in A549 cells

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4　不同濃度硒對A549細胞Bax表達的影響Figure 4　The effects of selenium on Bax expression in A549 cells

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5　不同濃度硒對A549細胞細胞色素C表達的影響Figure 5　The effects of selenium on level of cytochrome C in A549 cells

與對照組比較，*P<0.05， **P<0.01圖6　不同濃度硒對A549細胞caspase-3表達的影響Figure 6　The effects of selenium on caspase-3 expression in A549 cells

3討論

肺癌是一種發病率及死亡率極高的惡性腫瘤，對人類健康的危害日益嚴重。盡管采用了手術、化療、放療等多種治療方法，但5年存活率尚不足15%。21世紀，肺癌仍然是全球惡性腫瘤患者死亡的主要原因。現已明確，細胞凋亡機制在腫瘤發生發展中具有重要意義[4]。許多抗腫瘤的藥物都是通過誘導細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞[5,6]。

硒是人和動物的必需微量元素，有著廣泛的生物學效應。周嵐等[7]檢測了宣威女性肺癌患者癌組織、癌周組織、正常肺組織和血清硒含量，結果提示宣威地區女性肺癌的發生與低血硒狀態有關，肺組織低硒可能是導致癌變的潛在危險因素。趙秀香等[8]和Klarod等[9]的研究也表明肺癌患者血清硒含量明顯低于正常對照組，并且進展期肺癌患者血清硒又明顯低于早期患者。這些表明，血清硒水平與肺癌發生有著密切的關系，硒缺乏會增加癌癥的發生率。

本研究首先通過MTT實驗觀察到5 μmol/L和10 μmol/L硒能夠顯著性抑制A549細胞增殖活力。另外，流式細胞儀Annexin Ⅴ/PI雙染色法結果顯示：不同濃度硒能夠誘導A549細胞凋亡，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒能夠顯著性誘導A549細胞凋亡，這些說明硒能夠顯著誘導A549細胞凋亡。

線粒體凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑之一，Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要因子[10]，與腫瘤的發生發展密切相關[11]。在哺乳動物細胞中，Bcl-2家族分成兩類包括凋亡抑制因子和促凋亡因子。其中抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xl等，而促凋亡因子包括Bax、Bid等。激活的Bax蛋白能夠增加線粒體膜通透性使細胞色素C從線粒體釋放，再與結合同時激活caspase導致細胞凋亡[12]。caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者，其活化是凋亡進入不可逆轉的標志。

本研究結果顯示，經硒處理后的A549細胞中促凋亡分子Bax表達增加而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達下降，并且胞質中cytochrome C表達顯著性增加。本實驗結果還顯示，硒能夠顯著增加活化的caspase-3的表達。

通過以上實驗結果我們推斷：硒可能通過調控的Bcl-2及Bax表達，促進細胞色素C的釋放，并激活Caspase-3，最終通過線粒體途徑誘導A549細胞凋亡。

參考文獻：

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[7]周嵐，黃云超，王竹，等.宣威地區肺癌患者血清和肺組織硒水平研究[J].中國肺癌雜志，2011，14(1)：39-42.

[8]趙秀香,孟憲春,王進鴻.肺癌患者血清硒含量的研究[J].微量元素與健康研究，2001，18(3):25.

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[10]Vander Heiden MG,Thompson CB.Bcl-2 proteins:regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis[J].Nat Cell Biol,1999,1(8):E209-216.

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Effects of selenium on proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549 cells

LIU Yong1, XU Tianjiao2*, HUO Jinlian1, TIAN Yongqing1, LI Hairong1, CAO Xiangning1, HUANG Rui1, WANG Weiwei1

(1DepartmentofGeratology,XianyangHospitalofYan’anUniversity,Xianyang712000,China;2DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:xtj1118@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of selenium on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma cell line A549 cells and explore its mechanisms.MethodsThe A549 cells were treated with different concentrations of selenium(1,5,10 μmol/L) for 24 h and 48 h respectively, and the untreated cells were used as negative contols. The cell proliferation was measured using MTT, the cell apoptosis was measured by flow cytometry and the expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cytochrome C and caspase-3 was examined by Western blot.ResultsCompared with 24 h group, the proliferation was significantly inhibited after treated with the same concentration of selenium(5,10 mol/L) in 48 h group and 72 h group(P<0.05). Selenium significantly inhibited the proliferation in a concentration-dependent manner at the same time(P<0.05). Selenium significantly induced the apoptosis (P<0.05), markedly down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-xL and up-regulated expression of Bax, CytochromeC and Caspase-3 in a concentration-dependent manner(P<0.05).ConclusionSelenium can induce the apoptosis of A549 cells by regulating the expression of Bcl-2, Bax, cytochrome C and caspase-3.

Key words:selenium;lung adenocrcinoma;A549 cell;cell apoptosis

[收稿日期：2015-09-06]

作者簡介：劉勇，男，1976-10生，碩士，主治醫師，E-mail:15991883311@163.com.

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0031-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.008

基金項目：陜西省教育廳科研計劃基金資助項目(15JK1633)