地西他濱對惡性黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡及侵襲的影響

霍文亮　弓軍勝　李晉福　王鵬　張寶林

[摘要]目的：研究甲基化抑制劑地西他濱對人惡性黑色素瘤細胞A375增殖、凋亡及侵襲的影響。方法：采用不同濃度的地西他濱對A375細胞進行干預，用MTT實驗檢測地西他濱對細胞增殖的影響，用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期的變化，劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗觀察細胞體外遷徙侵襲能力的改變。結果：與對照組相比，地西他濱組A375細胞的增殖活性受到明顯抑制，凋亡比例顯著增加，體外遷移和侵襲能力減弱，差異有統計學意義（P<0.05），地西他濱對A375細胞周期的影響則無顯著差異（P>0.05）。結論：地西他濱能抑制惡性黑色素瘤A375細胞的增殖，其抗腫瘤效應有可能成為惡性黑色素瘤治療的新途徑。

[關鍵詞]黑色素瘤；地西他濱；增殖；凋亡；侵襲

[中圖分類號]R739.5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）03-0039-05

皮膚惡性黑色素瘤起源于黑色素細胞，惡性程度高，易發生遠處轉移，預后較差。早期惡性黑色素瘤以外科治療為主，但有1/3的患者就診時已出現局部轉移，并且1/5的早期手術患者可發生局部復發或遠處轉移。常規化療及放射性治療的臨床獲益率也不高。DNA的甲基化是最常見的表觀遺傳現象，當基因啟動子區的CpG島發生甲基化時，常導致基因轉錄沉寂，使重要基因如抑癌基因、修復基因等喪失功能，導致正常細胞的生長分化調控失常，以及DNA損傷不能被及時修復，DNA的異常甲基化與多種腫瘤形成密切相關。在惡性黑色素瘤中，DNA的異常甲基化與其發生及進展存在密切關系。值得注意的是，DNA的異常甲基化具有可逆性，異常甲基化引起的基因沉默現象可被甲基化抑制劑逆轉，本研究以人皮膚惡性黑色素瘤細胞A375為研究對象，觀察甲基化抑制劑地西他濱對其增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響，為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路和實驗依據。

1 研究方法

1.1 實驗材料與主要試劑

人皮膚惡性黑色素瘤A375細胞購自中科院上海細胞庫；地西他濱購自Sigema公司；DMEM高糖培養基、無支原體胎牛血清、胰酶、噻唑藍（MTT）及碘化丙啶（PI）夠自于Thermo fisher公司；凋亡檢測試劑盒夠自于Beckman公司；去鈣鎂離子Hanks平衡鹽溶液、PBS磷酸鹽平衡液、雙抗溶液（青、鏈霉素）夠自于博士德公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 細胞培養

A375細胞常規復蘇后，用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養基培養。培養箱條件：37℃，5%CO₂，飽和濕度，培養箱底層放置硫酸銅溶液。傳代時采用Hanks平衡鹽溶液漂洗3次，0.25%胰酶消化。

1.3 MTT實驗

懸浮指數增長期的A375細胞，調整濃度為1×10⁴個/ml，均勻接種到96孔板。細胞貼壁后更換培養基，加入待測藥物。分別加入0μmol/l（對照組）、1μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、125μmol/l的地西他濱。各濃度設5個重復孔。分別于加藥后24h、48h、72h進行MTT檢測，酶標儀測定波長490nm下的吸光值（A）。計算細胞生長抑制率，抑制率IR=（1-實驗組A/對照組A）×100%。

1.4 細胞凋亡及周期檢測

藥物干預24h后，AnnexinV-FITC/PI法檢測A375凋亡比例：收集各組的細胞，用冰PBS洗滌2次，1×bindingbuffer調整細胞濃度為10⁴/ml，加入5μl AnnexinV稀釋液混勻，再加入2.5μlPI混勻。避光、冰上孵育10min，加入400μl1× bindingbuffer，30min內置于流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測。細胞周期檢測：用冰PBS液洗滌2次，加入預冷的70%乙醇，于4℃冰箱過夜。離心收集細胞，冰PBS液洗滌2次，用1ml PBS懸浮細胞，分別加入10μl PI（50mg/m1）及10g/1的RNaseA 5μl。室溫避光30min后上流式細胞儀檢測。應用CELLquest系統進行分析，實驗重復3次，取平均值。

1.5 Transwell侵襲實驗

調整細胞濃度為10⁴/ml接種于Transwell孔板上室，上室培養基含不同濃度的藥物，胎牛血清濃度為10%。下室僅加入培養基，胎牛血清濃度20%。置37℃、5%CO₂、飽和濕度培養箱培養。24h后取出上室，去除上室的細胞，甲醛固定，蘇木精染色，置于倒置顯微鏡下觀察細胞通過情況，隨機計數十個視野（200×）取平均值進行統計分析。重復3次實驗，取平均值。

1.6 劃痕愈合實驗

將A375細胞接種于6孔板中，細胞生長至指數增長期時，用移液器槍尖進行劃痕處理，PBS液洗去脫落的細胞，拍照后繼續入培養箱培養。24h時對各組細胞再次拍照，圖片采用Image Pro Plus軟件進行分析。按照如下公式計算劃痕愈合率，劃痕愈合率（%）=（1各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%，重復3次實驗。

1.7 統計學方法

實驗結果采用SPSS16.0軟件分析，計量數據以均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 實驗結果

2.1 地西他濱對A375細胞增殖的影響

MTT實驗結果顯示：與對照組細胞相比，地西他濱對A375細胞的增殖活性受到抑制（P<0.05），從MTT結果繪制的生長曲線可以看出：隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，抑制率逐漸增高，即濃度和時間依賴性（見圖1）。

2.2 地西他濱對A375細胞凋亡及細胞周期的影響

24h時，自5μmol/l濃度開始，A375細胞的凋亡比例顯著增高，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05），說明地西他濱可有效誘導A375細胞凋亡（見表2，圖2）；24h時，25μmol/l及125μmol/l濃度組A375細胞G₀/G₁期比例顯著增高，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）（見表2，圖3）。

2.3 地西他濱對A375細胞侵襲能力的影響

對照組A375細胞通過微孔的數量為34.7±6.5，不同濃度地西他濱干預后A375細胞通過微孔的數量依次為32.0±8.2、28.8±7.2、20.3±6.1、15.5±3.4。其中：地西他濱25μmol/l及125μmol/l組與對照組的差異有統計學意義（P<0.05）（見圖4）。

2.4 地西他濱對A375細胞遷徙能力的影響

對照組及各濃度地西他濱組24h劃痕愈合面積依次為（70.7±7.1）%、（66.3±4.8）%、（60.2±8.5）%、（34.1±7.8）%、（12.5±4.8）%。其中：5μmol/l、25μmol/l及125μmol/l組與對照組的差異有統計學意義（P<0.05）（見圖5）。

3 討論

表觀遺傳學是指基于非核苷酸序列改變所致基因表達水平變化，DNA甲基化是最常見的表觀遺傳現象，腫瘤抑制基因啟動子區的異常甲基化是腫瘤發生過程中的顯著特征，在分子水平比較腫瘤組織和其對應的正常組織，DNA甲基化狀態的變化可能普遍存在，幾乎所有的腫瘤中都能找到異常的DNA甲基化。DNA甲基化可以使癌細胞在腫瘤發生早期，更傾向于通過一些改變了的信號傳導途徑擴增并獲得遺傳突變，從而具有選擇性，促進腫瘤的發生。在惡性黑色素瘤中亦存在DNA的異常甲基化：抑癌基因P16異常甲基化引起的細胞周期依賴性激酶抑制基因CDKN2A編碼失活可能與其發生密切相關。此外，與細胞凋亡，增殖調節相關的基因如：RASSFIA，RUNX3，SOCS1等異常甲基化現象在惡性黑色素瘤中也陸續被發現。總之，DNA異常甲基化引起的抑癌基因或調節基因失活被認為與惡性黑色素瘤的發病密切相關。

地西他濱是一種特異性的甲基化轉移酶抑制劑，其與甲基轉移酶共價結合形成復合物，不可逆地抑制該酶的甲基轉移活性而發揮去甲基化作用。目前，地西他濱已應用于臨床，主要治療骨髓增生異常綜合征、慢性粒細胞白血病等血液系統疾病，雖然地西他濱尚未應用于實體瘤的治療，但體外研究及動物實驗結果顯示其對實體瘤也具有一定的抗腫瘤效應。本研究觀察了地西他濱對惡性黑色素瘤A375細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲等生物學行為的影響。從MTT結果繪制的生長曲線可以看出，A375細胞的抑制率隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長逐漸增高，說明地西他濱對A375細胞的增殖抑制作用具有一定的濃度和時間依賴性。通過流式細胞檢測發現：經地西他濱處理的A375細胞凋亡比例顯著增加，同時處于G₀/G₁期的細胞比例增加，S期比例減少，細胞周期受到阻滯。腫瘤細胞侵襲能力反映其惡性程度，本研究采用transwell小室實驗模擬細胞侵襲過程，與對照組細胞相比，經地西他濱處理的A375細胞穿膜數量顯著降低，提示地西他濱在一定程度上降低了A375細胞的侵襲能力。同時，同一時間點地西他濱組A375細胞的劃痕愈合率明顯小于對照組，說明地西他濱減弱了腫瘤細胞的運動遷徙能力。

綜上研究結果表明：地西他濱在體外可有效抑制惡性黑色素瘤A375細胞生長、誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期，同時削弱A375細胞侵襲、遷徙能力，有望為惡性黑色素瘤的治療提供新的思路和實驗依據，而其作用的分子機制及體內應用的安全性等尚待進一步研究。

編輯/張惠娟