表阿霉素與替莫唑胺聯合應用對C6腦膠質瘤細胞增殖及凋亡作用

軒亞茹，應 雪，張春春，王亞華，閆荷露，李 霞

832000新疆石河子市，石河子大學藥學院特種植物藥資源教育部重點實驗室

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·論著·

表阿霉素與替莫唑胺聯合應用對C6腦膠質瘤細胞增殖及凋亡作用

軒亞茹，應 雪，張春春，王亞華，閆荷露，李 霞

832000新疆石河子市，石河子大學藥學院特種植物藥資源教育部重點實驗室

【摘要】目的探討表阿霉素(EPI)與替莫唑胺(TMZ)聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞和細胞腫瘤球的增殖抑制及誘導凋亡作用。方法培養C6腦膠質瘤細胞，取對數生長期細胞活性>95%的細胞進行實驗。取C6腦膠質瘤細胞接種于96孔細胞培養板中培養，24 h后加入各藥液10 μl至細胞培養孔中，細胞培養孔中EPI濃度梯度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μmol/L，TMZ的濃度梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L，繼續培養24 h和48 h。采用酶標儀在540 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值，計算各孔C6腦膠質瘤細胞的抑制率。取C6腦膠質瘤細胞接種于6孔板中，加入EPI、TMZ、EPI+TMZ(EPI終濃度為0.50、1.00、5.00 μmol/L，TMZ終濃度為1.0、5.0、10.0 μmol/L)，繼續培養24 h和48 h，經流式細胞儀檢測EPI和TMZ聯合對C6腦膠質瘤細胞的凋亡作用。培養C6腦膠質瘤細胞腫瘤球，加入EPI、TMZ、EPI+TMZ，EPI終濃度為5.00 μmol/L，TMZ的終濃度為10.0 μmol/L，分別于給藥后0、1、3、7 d于倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形態、球體是否有裂解、球核是否有壞死等現象。結果不同濃度的各藥物在24、48 h對C6腦膠質瘤細胞增殖的抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；各濃度EPI+TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞增殖的抑制率均高于相同EPI或TMZ濃度下單獨用藥，差異均有統計學意義(P<0.05)。培養至24 h時，1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈協同作用；培養至48 h時，0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈協同作用。培養至24、48 h時，陰性對照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對C6腦膠質瘤細胞凋亡率的比較，差異有統計學意義(P<0.05)。經EPI、TMZ及其聯合用藥后腫瘤球體積明顯受到抑制，表現為體積縮小，表面細胞裂解；聯合用藥較單獨用藥后腫瘤球球體致密性減小，裂解程度增大。結論EPI和TMZ聯合用藥對C6膠質瘤細胞具有協同抑制細胞增殖及誘導凋亡的作用，可引起C6腦膠質瘤細胞腫瘤球的裂解死亡。

【關鍵詞】神經膠質瘤；表柔比星；替莫唑胺；細胞增殖；細胞凋亡

軒亞茹，應雪，張春春，等.表阿霉素與替莫唑胺聯合應用對C6腦膠質瘤細胞增殖及凋亡作用[J].中國全科醫學，2016，19(8)：925-930.[www.chinagp.net]

Xuan YR，Ying X，Zhang CC，et al.Effect of the combined use of epirubicin and temozolomide in the proliferation and apoptosis of C6 glioma cells[J].Chinese General Practice，2016，19(8)：925-930.

腦膠質瘤是中樞神經系統最為常見的惡性腫瘤，預后較差，平均生存時間僅14.6個月，其中5年生存率不超過5%[1-2]。表阿霉素(EPI)是高效廣譜蒽環類衍生物抗腫瘤藥，主要作用機制是嵌入DNA鏈，形成抑制DNA和RNA合成的復合物，通過觸發拓撲異構酶Ⅱ引起DNA裂解，導致細胞死亡[3-4]。EPI已在臨床上用于治療乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、軟組織肉瘤、胰腺癌、胃癌、小細胞肺癌和白血病[5-7]，已有研究表明，其對腦膠質瘤細胞具有很好的抑制效果[8]。與阿霉素相比，EPI在可比劑量下表現出更小的血液和心肌毒性[9-10]。替莫唑胺(TMZ)是一類含有咪唑四嗪環的烷化劑抗腫瘤藥物，通過鳥嘌呤的O-6或N-7位上發生的DNA烷基化作用，導致腫瘤細胞死亡[11]。臨床治療腦膠質瘤的效果顯著[12-14]。目前，對EPI與TMZ聯合應用治療腦膠質瘤的研究報道較少。本研究旨在探討體外EPI聯合TMZ用藥對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡的影響，以及對腦膠質瘤細胞腫瘤球的抑制作用，為臨床腦腫瘤的治療提供實驗依據。

1材料和方法

1.1儀器和試劑CO2恒溫培養箱、超凈工作臺(美國Thermo科技有限公司)，臺式離心機(美國貝克曼公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細胞儀(FACSAria Ⅲ，美國BD公司)，酶標免疫測定儀(上海基因科技有限公司)，SartoriusBP211D電子天平(德國賽多利斯集團)；DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)，0.25%胰酶(美國Gibco公司)，雙抗(北京索萊寶生物技術有限公司)，PBS緩沖溶液(上海生工科技有限公司)，磺酰羅丹明B蛋白(SRB，美國Sigma公司)；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)。

1.2細胞株及培養條件C6腦膠質瘤細胞株購自中國科學院上海細胞庫。細胞培養條件為：DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱。取對數生長期活性>95%的細胞進行實驗。

1.3方法

1.3.1體外抗增殖作用取對數生長期C6腦膠質瘤細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔3 000個(含190 μl培養液)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后加入各藥液10 μl至細胞培養孔中，每種藥液濃度設4個復孔，另設溶劑對照4個復孔。各藥液分別為用無血清培養液配制的系列濃度的EPI、TMZ、EPI+TMZ，細胞培養孔中EPI的濃度梯度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μmol/L，TMZ的濃度梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L。將加好各藥液的細胞培養板置于培養箱中繼續培養24 h和48 h。培養完畢后，吸棄培養液，每孔加入4 ℃預冷的10%(W/V)三氯乙酸100 μl，靜置5 min后移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出用去離子水沖洗5次，室溫晾干。每孔加入0.4% SRB染液100 μl，室溫下染色15 min，棄去各孔內染液，用1%(V/V)乙酸沖洗5次，室溫晾干后，用非緩沖Tris-base堿液(10 mmol/L，pH=10.5)溶解，在平板振蕩器上振蕩20 min，采用酶標儀在540 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值，計算各孔C6腦膠質瘤細胞的抑制率，抑制率(%)=〔1-(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)〕×100%。

1.3.2藥物聯合作用評價[15]參照公式Q=Ee+t/(Ee+Et-Ee×Et)評價EPI和TMZ體外聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞毒性是否具有協同作用，其中Ee+t為聯合用藥抑制率，Ee和Et分別為EPI和TMZ的抑制率，分子代表“實測合并效應”，分母是“期望合并效應”。Q值0.86～1.15為單純相加作用(+)，Q值1.16～2.00為協同作用(++)，Q值0.55～0.85為拮抗作用(-)，Q值<0.55為明顯拮抗作用(--)。

1.3.3凋亡作用采用流式細胞儀檢測EPI和TMZ聯合對C6腦膠質瘤細胞的凋亡作用。取對數生長期C6腦膠質瘤細胞，接種于6孔板中，接種密度為2×105個/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養。24 h后，加入無血清培養液以及無血清培養液配置的EPI、TMZ、EPI+TMZ(EPI終濃度為0.50、1.00、5.00 μmol/L，TMZ終濃度為1.0、5.0、10.0 μmol/L)，置培養箱中繼續培養24 h和48 h。每組藥物設3個復孔，以無血清培養液為陰性對照。培養完畢后，用冷PBS漂洗3次，不含EDTA的胰酶消化；1 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌細胞2次；用300 μl的PBS將離心的下沉細胞吹勻，依次加入500 μl的Binding Buffer、5 μl Annexin V-APC、5 μl 7-AAD，混勻后于室溫避光的條件下反應10 min，經流式細胞儀檢測。

1.3.4C6腦膠質瘤細胞腫瘤球生長抑制實驗

1.3.4.1C6腦膠質瘤細胞腫瘤球的培養[16]配制2%(W/V)的瓊脂糖凝膠溶液，在80 ℃的水浴中加熱30 min，過濾滅菌；將150 μl C6腦膠質瘤細胞以2 000個/孔接種到96孔培養板中(該培養板中的每孔均預先加入40 μl瓊脂糖凝膠溶液包被)，在操作臺中輕輕晃動該培養板30 min，置37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，即可長成腫瘤球。

1.3.4.2藥物對C6腦膠質瘤細胞腫瘤球的抑制用無血清培養液配置EPI、TMZ、EPI+TMZ，每孔給藥體積為20 μl，EPI終濃度為5.00 μmol/L，TMZ的終濃度為10.0 μmol/L，以無血清培養液為陰性對照。分別于給藥后0、1、3、7 d于倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形態、球體是否有裂解、球核是否有壞死等現象。

2結果

2.1體外抗增殖作用不同濃度的各藥物在24、48h對C6腦膠質瘤細胞增殖的抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；各濃度EPI+TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞增殖的抑制率均高于相同EPI或TMZ濃度下單獨用藥，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1不同藥物對C6腦膠質瘤細胞增殖抑制率的比較

Table1ComparisonofproliferationinhibitionrateofC6gliomacellsamongdifferentdrugs

藥物濃度(μmol/L)抑制率24h 48hEPI0.053.71±0.525.38±1.340.107.74±1.2413.97±1.320.5011.63±0.2228.56±1.281.0022.43±0.8649.40±0.755.0041.89±1.8562.85±1.2810.0061.20±1.9881.99±2.55TMZ0.11.60±0.173.53±0.270.55.79±0.7113.83±1.921.09.94±0.9124.74±1.345.030.30±0.3051.43±1.3410.040.03±0.6463.62±1.7820.053.58±1.3973.65±1.66EPI+TMZ0-1.97±0.59-1.11±0.150.05+0.15.85±1.10ab6.47±1.800.10+0.512.53±2.42ab22.08±1.43ab0.50+1.021.64±2.18ab52.14±1.63ab1.00+5.054.11±3.16ab73.33±1.90ab5.00+10.073.29±2.62ab86.54±2.39ab10.00+20.090.48±2.66ab98.25±1.32abF值936.25535.25P值<0.001<0.001

注：EPI=表阿霉素，TMZ=替莫唑胺；與同一濃度EPI比較，aP<0.05；與同一濃度TMZ比較，bP<0.05

2.2兩藥聯合作用培養至24 h時，0.05 μmol/L EPI與0.1 μmol/L TMZ、0.10 μmol/L EPI與0.5 μmol/L TMZ、0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI與10.0 μmol/L TMZ、10.00 μmol/L EPI與20.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈相加作用，1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈協同作用；培養至48 h時，0.05 μmol/L EPI與0.1 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈拮抗作用，0.10 μmol/L EPI與0.5 μmol/L TMZ、1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI與10.0 μmol/L TMZ、10.00 μmol/L EPI與20.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈相加作用，0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制率呈協同作用(見表2)。

表2　EPI與TMZ對C6腦膠質瘤細胞的聯合作用

注：++表示協同作用，+表示相加作用，-表示拮抗作用

2.3凋亡作用培養至24 h時，陰性對照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對C6腦膠質瘤細胞凋亡率的比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中，1.00 μmol/L和5.00 μmol/L EPI、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L TMZ及各濃度的EPI+TMZ對C6腦膠質瘤細胞凋亡率高于陰性對照，1.00 μmol/L EPI和5.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI和10.0 μmol/L TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞凋亡率均高于同一濃度的EPI、TMZ單獨用藥，差異有統計學意義(P<0.05)。培養至48 h時，陰性對照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對C6腦膠質瘤細胞凋亡率的比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中，1.00 μmol/L和5.00 μmol/L EPI、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L TMZ及各濃度的EPI+TMZ對C6腦膠質瘤細胞凋亡率高于陰性對照，各濃度聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞凋亡率均高于同一濃度的EPI、TMZ單獨用藥，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

表3EPI、TMZ及其聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞凋亡率的比較

Table3ComparisonofapoptosisrateofC6gliomacellsbetweenEPIorTMZaloneandEPI+TMZ

干預濃度(μmol/L)凋亡率24h 48h陰性對照-4.67±1.035.29±0.89EPI0.505.96±1.027.17±1.441.0011.73±0.87a16.10±1.32a5.0026.86±1.55a35.18±1.65aTMZ 1.0 5.09±1.575.84±1.30 5.0 9.22±1.09a14.04±1.41a10.023.43±3.01a30.67±2.22aEPI+TMZ0.50+1.07.78±1.39a11.27±1.68abc1.00+5.026.59±0.93abc31.96±1.74abc5.00+10.038.19±1.73abc56.50±2.49abcF值176.63290.90P值<0.001<0.001

注：與陰性對照比較，aP<0.01；與同一濃度EPI比較，bP<0.05；與同一濃度TMZ比較，cP<0.05

2.4C6腦膠質瘤細胞腫瘤球的生長抑制作用陰性對照C6腦膠質瘤腫瘤球細胞生長致密，增殖速度較快，腫瘤體積隨培養時間明顯增大。經EPI、TMZ及其聯合用藥后腫瘤球體積明顯受到抑制，表現為體積縮小，表面細胞裂解；聯合用藥較單獨用藥后腫瘤球球體致密性減小，裂解程度增大(見圖1，本文彩圖請登錄本刊官網www.chinagp.net查看)。

3討論

腦膠質瘤為常見的顱內腫瘤，約占腦腫瘤患者的50%，由于其呈浸潤性生長，無明顯邊界，手術不能完全根除，導致臨床治愈率低，生存期短，病死率高，其中惡性腦膠質瘤患者5年生存率不足5%，病死率僅次于胰腺癌和肺癌，位居第3位[17-18]。化療作為腦膠質瘤手術后的輔助治療，為清除殘余腫瘤細胞或抑制腫瘤復發提供可能。因此，開發對腦膠質瘤的治療敏感有效、毒副作用小且經濟適用的新的化療方案成為當今研究熱點。

TMZ是目前臨床一線腦膠質瘤化療藥物，易于通過血-腦脊液屏障，能使腦膠質瘤細胞DNA烷基化，發揮其細胞毒作用[19]。EPI為一種作用于細胞周期的非特異性藥物，是目前一線抗腫瘤藥物，對多種實體瘤有效，其作用部位在細胞核，作用機制主要為進入細胞核與DNA結合，從而抑制核酸的合成和有絲分裂，引起細胞凋亡[20-21]。

本研究采用EPI聯合TMZ作用于C6腦膠質瘤細胞，表現出較單獨用藥更強的抗增殖和促凋亡作用，且受時間和劑量的影響。培養24 h時，EPI(1.00 μmol/L)和TMZ(5.0 μmol/L)聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制表現為協同增強作用；培養48 h時，EPI(0.50 μmol/L)和TMZ(1.0 μmol/L)聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制表現為協同增強的作用，提示聯合用藥低劑量作用較長時間或高劑量作用較短時間均可增強對C6腦膠質瘤細胞的抗增殖作用。當聯合用藥劑量提高到EPI(5.00 μmol/L)和TMZ(10.0 μmol/L)，在24、48 h時抑制率分別為73%和86%，凋亡率分別為38%和56%，可能因為給藥濃度較高引起細胞死亡增加。聯合用藥后的抗增殖和促凋亡增強作用可能是因為EPI和TMZ能夠分別迅速進入體外培養的細胞及細胞核內，與DNA結合[22]或使DNA烷基化[23-24]，發揮細胞毒作用，引起細胞的凋亡甚至死亡。

然而，大多數腦腫瘤為實體瘤，腫瘤內的無血管區域能夠阻止藥物滲透到腫瘤的中心部位[25]。體外單層細胞的作用很強未必對體內實體瘤同樣有效。與單層細胞的培養不同，神經膠質瘤體外三維球體模型(簡稱腫瘤球)可模擬實體瘤的無血管區域，更接近于體內腫瘤的細胞結構和環境[26]。通過評估藥物體外對腫瘤球的抑制作用，從而預測其在體內對腫瘤的抑制效果[27]。本研究接種細胞后向同一方向晃動培養板，可將大部分細胞集中到培養板的中心位置，晃動時間過短，培養后形成多個分散的小聚集，無法對其定位拍照，預實驗結果顯示晃動25～30 min時，24 h后96孔板的大部分孔內只在中央位置形成一個大的細胞聚集，培養時間越長，聚集的細胞生長越緊密，形狀更加接近球形；預先向96孔板內加入2%瓊脂糖可為球體的形成提供骨架支撐，使細胞生長更為致密、行成的球體更加圓整。作用7 d后，陰性對照腫瘤球表面有輕微裂解，可能是由于培養時間長、球體過大，周圍環境不足以提供細胞快速增殖需要的營養物質，而引起腫瘤球表面細胞死亡裂解[28-29]。與干預3 d后比較，EPI、TMZ單獨用藥7 d后腫瘤球變化不明顯，分析原因可能為：(1)腫瘤球生長致密，藥物無法滲透到球體內部；(2)單獨給藥作用較弱，只能引起腫瘤球表面細胞的死亡；(3)單次給藥作用3～7 d，藥物濃度下降，過低的濃度不足以使細胞凋亡。隨時間延長，EPI+TMZ聯合用藥干預的腫瘤球裂解比較明顯，但7 d時球體中間部分仍很致密，繼續(多次)給藥可能使腫瘤球進一步裂解，直至球體完全裂解。本研究的結果顯示，與陰性對照、EPI及TMZ單獨用藥比較，EPI+TMZ聯合用藥更能有效地滲透至腫瘤球內部，進而抑制細胞增殖，減小腫瘤體積，預示臨床上EPI聯合TMZ用于治療腦膠質瘤的可能性，提示一定濃度下多次給藥，對實體腫瘤的治療更為有效。

注：A0、A1、A3、A7分別為陰性對照干預后第0、1、3、7天，B0、B1、B3、B7分別為EPI干預后第0、1、3、7天，C0、C1、C3、C7分別為TMZ干預后第0、1、3、7天，D0、D1、D3、D7分別為EPI+TMZ干預后第0、1、3、7 d天；圖中標尺為100 μm

圖1EPI、TMZ及其聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞腫瘤球的抑制作用(×100)

Figure 1Inhibiting effect of EPI，TMZ and EPI+TMZ on C6 glioma spheroids

本研究探討了EPI及TMZ聯合用藥對C6腦膠質瘤細胞的增殖抑制及誘導凋亡的作用，為臨床腦膠質瘤的治療提供一定的實驗和理論基礎，但其復雜的聯合作用機制，仍需進一步研究。

作者貢獻：軒亞茹進行課題設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張春春、王亞華、閆荷露、李霞進行課題實施、評估、資料收集；應雪進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer，2010，127(12)：2893-2917.

[2]Dolecek TA，Propp JM，Stroup NE，et al.CBTRUS statistical report:primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009[J].Neuro Oncol，2012，14(Suppl 5):v1-49.

[3]Yuyama Y，Yagihashi A，Hirata K，et al.The effects of epirubicin hydrochloride(EPI) plus pretreatment of medroxyprogesterone acetate(MPA) on FM3A breast cancer cells transplanted in female C3H/He mice[J].In Vivo，2003，17(3):251-254.

[4]Altinoz MA，Bilir A，Gedikoglu G，et al.Medroxyprogesterone and tamoxifen augment anti-proliferative efficacy and reduce mitochondria-toxicity of epirubicin in FM3A tumor cells in vitro[J].Cell Biol Int，2007，31(5):473-481.

[5]Smith LA，Cornelius VR，Plummer CJ，et al.Cardiotoxicity of anthracycline agents for the treatment of cancer:systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials[J].BMC Cancer，2010(10):337.

[6]van Dalen EC，Michiels EM，Caron HN，et al.Different anthracycline derivates for reducing cardiotoxicity in cancer patients[J].Cochrane Database Syst Rev，2010(5):CD005006.

[7]Kim SJ，Seo HY，Choi JG，et al.Phase Ⅱ study with a combination of epirubicin，cisplatin，UFT，and leucovorin in advanced hepatocellular carcinoma[J].Cancer Chemother Pharmacol，2006，57(4):436-442.

[8]Tian W，Ying X，Du J，et al.Enhanced efficacy of functionalized epirubicin liposomes in treating brain glioma-bearing rats[J].Eur J Pharm Sci，2010，41(2):232-243.

[9]Salvatorelli E，Guarnieri S，Menna P，et al.Defective one-or two-electron reduction of the anticancer anthracycline epirubicin in human heart[J].J Biol Chem，2006，281(16):10990-11001.

[10]Birtle AJ.Anthracyclines and cardiotoxicity[J].Clin Oncol(R Coll Radiol)，2000，12(3):146-152.

[11]Di Martino A，Sedlarik V.Amphiphilic chitosan-grafted-functionalized polylactic acid based nanoparticles as a delivery system for doxorubicin and temozolomide co-therapy[J].Int J Pharma，2014，474(1/2):134-145.

[12]Zhang H，Gao S.Temozolomide/PLGA microparticles and antitumor activityagainst glioma C6 cancer cells in vitro[J].Int J Pharm，2007，329(1/2):122-128.

[13]Mathieu D，Fortin D.Chemotherapy and delivery in the treatment of primary brain tumors[J].Curr Clin Pharmacol，2007，2(3):197-211.

[14]Macdonald DR.Temozolomide for recurrent high-grade glioma[J].Semin Oncol，2001，28(13):3-12.

[15]Meng TT，Wei H，Guan DF，et al.Influence of curcumin on the proliferation and apoptosis of HL-60 cells and its mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(23)：2800-2804.(in Chinese)

孟騰騰，魏虹，管東方，等.姜黃素對人早幼粒白血病細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究[J].中國全科醫學，2015，18(23)：2800-2804.

[16]Ying X，Wen H，Lu WL，et al.Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals[J].J Control Release，2010，141(2):183-192.

[17]Zhang P，Hu L，Yin Q，et al.Transferrin-modified c[RGDfK]-paclitaxel loaded hybrid micelle for sequential blood-brain barrier penetration and glioma targeting therapy[J].Mol Pharm，2012，9(6):1590-1598.

[18]Mangiola A，Anile C，Pompucci A，et al.Glioblastoma therapy:going beyond hercules columns[J].Expert Rev Neurother，2010，10(4):507-514.

[19]Kong B，Sun Y，Li Y，et al.Preparation and the influencing factors of timozolomide liposomes[J].2009，37(6):279-282.

[20]Kebieche M，Lakroun Z，Lahouel M，et al.Evaluation of epirubicin-induced acute oxidative stress toxicity in rat liver cells and mitochondria，and the prevention of toxicity through quercetin administration[J].Exp Toxicol Pathol，2009，61(2):161-167.

[21]Mays AN，Osheroff N，Xiao Y，et al.Evidence for direct involvement of epirubicin in the formation of chromosomal translocations in therapy-related acute promyelocytic leukemia[J].Blood，2010，115(2):326-330.

[22]Zhu AX，Fuchs CS，Clark JW，et al.A phaseⅡ study of epirubicin and thalidomide in unresectable or metastatic hepatocellular carcinoma[J].Oncologist，2005，10(6):392-398.

[23]Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].N Engl J Med，2005，352(10):987-996.

[24]Wei X，Chen X，Ying M，et al.Brain tumor-targeted drug delivery strategies[J].Acta Pharma Sin B，2014，4(3):193-201.

[25]Al-Jamal WT，Al-Jamal KT，Bomans PH，et al.Functionalized quantum dot liposome hybrids as multimodal nanoparticles for cancer[J].Small，2008，4(9):1406-1415.

[26]Al-Abd AM，Lee SH，Kim SH，et al.Penetration and efficacy of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles in a human solid tumor model in-vitro[J].J Control Release，2009，137(2):130-135.

[27]Dhanikula RS，Argaw A，Bouchard JF，et al.Methotrexate loaded polyether-copolyester dendrimers for the treatment of gliomas:enhanced efficacy and intratumoral transport capability[J].Mol Pharm，2008，5(1):105-116.

[28]Goldbrunner RH，Bernstein JJ，Plate KH，et al.Vascularization of human glioma spheroids implanted into rat cortex is conferred by two distinct mechanisms[J].J Neurosci Res，1999，55(4):486-495.

[29]Kostarelos K，Emfietzoglou D，Papakostas A，et al.Binding and interstitial penetration of liposomes within avascular tumor spheroids[J].Int J Cancer，2004，112(4):713-721.

(本文編輯：吳立波)

Effect of the Combined Use of Epirubicin and Temozolomide in the Proliferation and Apoptosis of C6 Glioma Cells

XUANYa-ru，YINGXue，ZHANGChun-chun，etal.

KeyLaboratoryofXinjiangPhytomedicineResourcesandModernizationofTCM，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the combined used of epirubicin(EPI) and temozolomide(TMZ) on the proliferation and apoptosis of C6 glioma cells and C6 glioma spheroids.MethodsTo carry out the experiments，we used C6 glioma cells which were in the logarithmic phase and their cell activity was more than 95%.These C6 glioma cells were seeded into 96-well culture plates for 24 h.Then EPI and TMZ were severally added into 96-well culture plates with 10μl each and the concentration gradients were 0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 μmol/L and 0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L，respectively.24 h and 48 h later，the absorbance was read on a microplate reader at 540 nm.The inhibition rate of C6 glioma cells in each hole was calculated after the above process.C6 glioma cells were seeded into 6-well culture plates and then EPI，TMZ and EPI+TMZ were added and the final concentrations of EPI were 0.50，1.00，5.00 μmol/L and those of TMZ were 1.0，5.0，10.0 μmol/L，respectively.After continuous culture for 24 h and 48 h，the apoptosis effect of EPI combined with TMZ was determined by flow cytometry.C6 glioma spheroids in vitro were developed and then EPI，TMZ，EPI+TMZ were added and the final concentrations of EPI and TMZ were 5.00 μmol/L and 10.0 μmol/L respectively.On the 0，1，3，7 d after adding the drugs，we used the inverted microscope to observe the morphologic changes of C6 glioma spheroids to see if the spheroids produced splitting decomposition and the spheroids nuclear had necrosis.ResultsThe inhibition rates of C6 glioma cells were significantly different among the drugs of different concentrations at 24 h and 48 h(P<0.05);the inhibition rates of EPI+TMZ were significantly higher than EPI or TMZ alone under the same concentration(P<0.05).The inhibition rates of C6 glioma cells showed synergy after adding 1.00 μmol/L EPI combined with 5.0 μmol/L TMZ at 24 h and 0.50 μmol/L EPI combined with 1.0 μmol/L TMZ at 48 h.At 24 h and 48 h，significant differences existed in the apoptosis rate of C6 glioma cells among negative control group and EPI，TMZ and EPI+TMZ groups of different concentrations(P<0.05).EPI，TMZ and EPI+TMZ evidently inhibited the volume of tumor spheres，with specific manifestations of shrinking volume and cell disruption on the surface;EPI+TMZ more obviously reduced the compactness of tumor spheres and caused greater splitting decomposition than EPI or TMZ alone.ConclusionThe combined application of EPI and TMZ could produce a significant synergic effect on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of C6 glioma cells，and result in pyrolysis or death of C6 glioma spheroids.

【Key words】Glioma ；Epirubicin；Temozolomide；Cell proliferation；Apoptosis

(收稿日期：2015-10-20；修回日期：2016-01-22)

【中圖分類號】R 730.264

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.08.013

通信作者：應雪，832000新疆石河子市，石河子大學藥學院特種植物藥資源教育部重點實驗室；E-mail：yingxue2011@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160396，81460540)；石河子大學杰出青年科技人才培育計劃項目(2012ZRKXJQ07)；新疆生產建設兵團社會發展科技攻關與成果轉化計劃項目(2015AD007)；石河子大學大學生創新創業訓練計劃項目(SRP2015256)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510759066)