黃瓜DVR基因的生物信息學分析

洪蓓蓓

摘 要：聯乙烯還原酶（divinyl reductase，DVR）將各種葉綠素中間物質的8-乙烯基轉化為乙基，是生物合成葉綠素必不可少的一個關鍵酶。本文用生物信息分析方法對黃瓜DVR基因編碼的氨基酸序列與組成、疏水性/親水性、理化性質等進行分析與預測。結果表明DVR基因全長1260 bp，編碼419個氨基酸，推測為親水性的非跨膜類蛋白。根據同源序列的遺傳距離得知黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）同源基因關系最近，其次為香瓜，與鷹嘴豆基因關系最遠。

關鍵詞：黃瓜；聯乙烯還原酶；生物信息學分析

黃瓜（Cucumissativus L. var.sativus）又稱胡瓜，是葫蘆科、甜瓜屬植物，起源于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)，是葫蘆科甜瓜屬一年生草本蔓生攀緣植物[1]。黃瓜雌雄同株，雄花：常數朵在葉腋簇生；花梗纖細；花冠黃白色，花冠裂片長圓狀披針形。雌花：單生或簇生；花梗粗壯；子房粗糙。果實長圓形或圓柱形，熟時黃綠色，表面粗糙，花果期夏季[2]。黃瓜味甘性涼，具有清熱利水，解毒的功效。黃瓜含水分為98%，并含有少量的維生素C、胡蘿卜素、蛋白質、鈣、磷、鐵、維生素（VA、VB1、VB2、VC、VE）等人體必需的營養(yǎng)素[3]。食用方便，可生食或烹調用。現代藥理學研究認為，黃瓜中含有的丙醇二酸能抑制糖類物質轉化為脂肪，葫蘆索C可抗癌，黃瓜汁有美容功效[4]。

聯乙烯還原酶[5]是一種膜結合蛋白，它嵌入質體和葉綠體膜中，催化卟啉環(huán)上的C-8位乙烯基還原為乙基，是植物體內合成正常的MV-Chl必不可少的一個關鍵酶。在高等植物中各種DVR的基因活性是由一個基因編碼的具有廣譜底物專化性的DVR蛋白所催化，來源于不同物種的DVR蛋白的催化活性具有極顯著的差異，并且即使是同一個DVR蛋白，對不同的聯乙烯底物也可能具有顯著不同的催化活性[6]。可見，對黃瓜聯乙烯還原酶的結構和功能進行推斷和預測具有一定的生物學意義，故本文將對黃瓜聯乙烯還原酶的生物信息學進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃瓜DVR基因序列來源于實驗獲得，從在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）核酸及蛋白質數據庫中檢索得到。同時通過檢索與黃瓜DVR基因具有較為相近同源序列的基因：黃瓜（登錄號JX239753.1）、香瓜Cucumismelo（登錄號XM_008440580.1）、野草莓Fragariavesca subsp. vesca（登錄號XM_004296747.2）、白梨Pyrus xbretschneideri（登錄號XM_009347536.1）、白梨Pyrusx bretschneideri（登錄號XM_009347528.1）、白梨Pyrus x bretschneideri（登錄號XM_009370831.1）、白梨Pyrus xbretschneideri（登錄號XM_009353937.1）、鷹嘴豆Cicerarietinum（登錄號XM_004486002.2）。

1.2 實驗方法

通過軟件primer 5.0獲得相應的氨基酸序列[7]；MEGA3.1軟件采用Neighbor-Joining的方法進行進化樹分析

[8]；通過npsa-prabi在線工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行二級結構預測；通過Protscale（http：//expasy.org/tools/protscale.html）預測分析蛋白質功能和疏水性/親水性[9]；利用CBS網站TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線工具對氨基酸序列進行跨膜分析預測[10]。

2 結果與分析

2.1 黃瓜DVR基因序列的分析

根據DNAMAN軟件分析可知，DVR基因序列全長1260pb，分別以ATG和TGA為起始密碼子和終止密碼子，共編碼419個殘基（圖1），編碼的蛋白質分子質量為45516 Da。

2.2黃瓜DVR及其同源序列的分析進化樹

根據MEGA軟件分析，將進化樹分為五段，分別是四種白梨、野草莓、香瓜、兩種黃瓜和鷹嘴豆（圖2）。黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）的同源基因關系最為接近，幾乎完全相同，其次為香瓜，測得黃瓜與香瓜的同源距離約為0.029，與鷹嘴豆基因關系最遠，測得它們之間的距離達到0.357。

2.3 黃瓜DVR蛋白二級結構預測

通過sopma在線軟件預測可知，該蛋白由419個氨基酸組成，其中α螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例最高，α螺旋有146個，占總數的34.84%，無規(guī)則卷曲有140個，占總數的33.41%。β折疊數量略少于無規(guī)則卷曲，但遠多于β轉角（圖3）。

2.4 黃瓜DVR蛋白跨膜結構分析

跨膜結構域一般富含疏水性氨基酸殘基，起著固系于細胞膜中的“拋錨”作用，具有跨膜結構域的蛋白屬于跨膜蛋白類。通過TMHMM在線軟件預測可知，橫坐標表示氨基酸殘基位置，縱坐標表示殘基具有相應結構的可能性， 結果顯示，聯乙烯還原酶蛋白沒有檢測到跨膜區(qū)，可能不是跨膜蛋白，聯乙烯還原酶蛋白極可能為覆蓋蛋白（圖4）。

2.5 黃瓜DVR蛋白的親疏水性預測

用protscale軟件分析可知，圖中大于零的氨基酸為疏水性氨基酸，小于零的氨基酸為親水性的氨基酸。通過預測可知，組成聯乙烯還原酶蛋白的氨基酸中高親水性的氨基酸的位點有兩個（圖5），分別是57和58，分值都是-2.667；組成聯乙烯還原酶蛋白的氨基酸中高疏水性的氨基酸的位點206，分值是2.978。

3 討論

本實驗預測得黃瓜聯乙烯還原酶蛋白為親水性的非跨膜類蛋白，通過對蛋白質二級結構的預測可知，黃瓜聯乙烯還原酶蛋白二級結構以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主；根據同源序列的遺傳距離得知黃瓜DVR與黃瓜（JX239753.1）同源基因關系最近，與鷹嘴豆基因關系最遠。

絕大多數綠色植物進行光合作用離不開葉綠體的存在[11]，而聯乙烯還原酶是生物合成葉綠素必不可少的一個關鍵酶，迄今已在高等植物中檢測到5種DVR活性[12]。聯乙烯還原酶具有活性，對葉綠素的生物合成途徑具有十分重要的意義

[13]。聯乙烯蛋白酶基因的突變可能會引起聯乙烯還原酶失活，對植物的生存、生長和繁殖造成較大的影響

[15]。應用生物信息學方法對已知黃瓜DVR序列進行比對、分析，從而對其結構和功能進行推斷和預測，這可以為我們在開展試驗研究前提供盡可能多的信息，從而為選擇合適的試驗方法提供理論參考，為進一步對該基因的功能研究提供線索。

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（作者單位：臺州學院 英語系，浙江 臨海 317000）