固液相色譜法同時(shí)檢測畜禽糞便抗生素的方法

摘要：目的：使用固相萃取——高效液相色譜法檢測畜禽糞便中的抗生素殘留。方法：使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液（pH=4.0）提取家禽糞便樣品，經(jīng)HLB固相萃取小柱純化富集，以及高效液相色譜分離檢測。結(jié)果：3信倍噪比下四環(huán)素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶的檢出限分別為0.20～7.20μg/kg、0.16～3.15μg/kg、0.05μg/kg，三種抗生素豬糞的加標(biāo)回收率分別為60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標(biāo)回收率分別為70%～101%、65%～99%、115%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)差均在2.5%～9.3%之間。結(jié)論：固液相色譜法具較高的準(zhǔn)確度，可對禽糞便四環(huán)素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類抗生素同時(shí)檢出。

關(guān)鍵詞：家禽糞便；固相萃取；高效液相色譜

中圖分類號： X132 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.17.026

隨著社會的不斷發(fā)展，家禽養(yǎng)殖業(yè)也逐漸向現(xiàn)代化方向發(fā)展，規(guī)模化、集約化的養(yǎng)殖方式出現(xiàn)，使得抗生素家禽養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用[1]。而抗生素在家禽體內(nèi)的吸收性差，約有30%～90%的抗生素會以原藥的形式隨著糞便從家禽體內(nèi)排除[2]，對土壤及地表水源造成污染。因此需要對家禽糞便中抗生素予以分析檢測，以減少抗生素對環(huán)境的污染。筆者本次主要分析固液相色譜法同時(shí)對檢測畜禽糞便抗生素的方法，內(nèi)容如下：

1 儀器與試劑

1.1 儀器與試劑

HLB固相萃取柱、Visiprep TM-DL固相萃取裝置、WD-12氮吹儀、Agilent-1200高效液相色譜儀、ASE300加速溶劑萃取裝置；土霉素、四環(huán)素、金霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、諾美沙星；甲醇、乙腈（色譜純）檸檬酸、EDTA鈉鹽、NaOH等試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2溶液配制

稱取各類所需抗生素1毫克分別裝入10毫升容量瓶中。使用甲醇溶解四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

1.3樣品采集與處理

采集新鮮家禽糞便（選擇本地區(qū)規(guī)模化家禽養(yǎng)殖場）樣品冷凍干燥后，粉碎過篩，在家禽糞便樣品中加入抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋震蕩1分鐘，常溫下超聲20分鐘，4℃下10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液10毫升，重復(fù)上述步驟2次，分別取上清液10毫升、5毫升，將三次提取上清液混合后，取5毫升予以超純水稀釋（甲醇含量<10%），過固相萃取小柱，依次使用5毫升甲醇和5毫升 0.2mol檸檬酸溶液火化，將以上提取物以5毫升/分鐘流速過柱，依次使用10毫升 5%甲醇溶液和10毫升水沖洗HLB小柱，用10毫升二氯甲烷洗脫目標(biāo)抗生素，洗脫液在氮?dú)庀麓蹈芍?.1毫升以下。加入1μg內(nèi)標(biāo)物質(zhì)LOM，使用甲醇——水混合液定容至1毫升，供HPLC-MS/NS檢定。

1.4色譜條件

采用InertsilODS-3色譜柱；流動相為乙腈（ A） 和1%乙酸（B），流速為0.8毫升/分鐘；柱溫30℃；梯度洗脫程序： 0～18分鐘，10% A；18～20分鐘，37%，80% A。

2結(jié)果

分別在各類樣品中添加四環(huán)素類、喹諾酮類、硫胺二甲嘧啶類抗生素1μg/g、5μg/g、10μg/g三個含量水平，結(jié)果顯示豬糞的加標(biāo)回收率分別為60%～100%、41%～120%、94%～101%，雞糞的加標(biāo)回收率分別為70%～101%、65%～99%、115%～120%。相對標(biāo)準(zhǔn)差均在2.5%～9.3%之間，說明檢測方法的準(zhǔn)確性和精密度高。

3討論

由于家禽糞便樣品復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和各種無機(jī)成分，因此在對樣品進(jìn)行選擇時(shí)要確保標(biāo)準(zhǔn)物的定量。而在凈化步驟中，對環(huán)境樣品中抗生素前處理，HLB為目前效果最佳的柱子[3]。在洗脫實(shí)驗(yàn)中選擇二氯甲烷作為洗脫機(jī)，主要是由于二氯甲烷對金霉素的洗脫率好，且洗脫下來的雜質(zhì)少，使色譜圖中的目標(biāo)分離物和檢測不受干擾。

抗生素是一種可離子化的極性有機(jī)化合物，因此流動相的pH值對抗生素物質(zhì)的分離和檢測非常重要，一般選擇有機(jī)溶劑和緩沖液按照一定比例混合，最常見的有機(jī)溶劑為乙腈和甲醇，其對紫外線的吸收率低，緩沖液選擇乙酸，主要是乙酸作為流動相的峰形好。過低的pH會降低色譜柱的使用范圍，一般緩沖液的pH值控制在2～3內(nèi)，流動相選擇1%乙酸（pH=2.6）。在檢測時(shí)選擇270毫米作為檢測波長，主要使用270毫米檢測波長，對四環(huán)素、氟喹諾酮氨磺二甲嘧啶三種抗生素均具有較高的響應(yīng)值，且分布相對均勻。

綜上所述：固液相色譜法具較高的準(zhǔn)確度，可對禽糞便四環(huán)素、喹諾酮及磺胺二甲嘧啶類抗生素同時(shí)檢出。

參考文獻(xiàn)

[1]李艷霞，李帷，張雪蓮，等.固相萃取4高效液相色譜法同時(shí)檢測畜禽糞便中14 種獸藥抗生素[J].分析化學(xué)研究報(bào)告，2012，40（02）：213-217.

[2]王麗，鐘冬蓮，陳光才，等.固相萃取——高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽糞便中的殘留抗生素[J].色譜，2013，31（10）：1010-1015.

[3]張敏，劉慶玉，敖永華.高效液相色譜——熒光檢測畜禽糞污中四種氟喹諾酮類抗生素殘留[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（03）：602-604.

作者簡介：王忠琴，大專學(xué)歷，輝南縣輝發(fā)城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，獸醫(yī)師，研究方向：動物檢疫。