ADAM17和Notch1在浸潤性乳腺癌組織中的表達及意義

張艷，胡寶山，楊慧敏，孫影，張雪鵬

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2華北理工大學基礎醫學院)

ADAM17和Notch1在浸潤性乳腺癌組織中的表達及意義

張艷1，胡寶山1，楊慧敏2，孫影2，張雪鵬1

(1華北理工大學附屬醫院，河北唐山063000；2華北理工大學基礎醫學院)

目的 探討解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)、Notch1在浸潤性乳腺癌發生、發展中的作用。方法 采用免疫組化法檢測正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤性乳腺癌組織石蠟標本(均為30例份)ADAM17和Notch1染色指數及蛋白陽性表達率，分析二者的相關性及二者與浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征的關系。采用Western blotting法檢測新鮮凍存正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤性乳腺癌組織(均為10例份)ADAM17、Notch1蛋白相對表達量。結果 正常乳腺、乳腺纖維腺瘤、浸潤性乳腺癌標本及組織中ADAM17、Notch1染色指數和蛋白相對表達量均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺、乳腺纖維腺瘤及浸潤性乳腺癌標本ADAM17蛋白陽性表達率分別為3.3%、10.0%、83.3%，Notch1蛋白陽性表達率分別為0、6.7%、76.7%；浸潤性乳腺癌標本 ADAM17、Notch1陽性表達率均高于正常乳腺、乳腺纖維腺瘤標本(P均<0.05)。浸潤性乳腺癌標本ADAM17和Notch1陽性表達率呈正相關(r=0.504，P<0.05)。浸潤性乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白陽性表達率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)，均與腋窩淋巴結轉移有關(P<0.05或<0.01)。結論 浸潤性乳腺癌組織中ADAM17和Notch1蛋白表達升高，其異常表達可能與腫瘤淋巴結轉移有關。

浸潤性乳腺癌；解聚素-金屬蛋白酶17；Notch1

調控腫瘤生長的信號轉導途徑是個龐大而復雜的網絡系統，涉及到多條通路之間的交互和整合。目前研究表明Notch信號通路是細胞間信息交流的重要通路，也是許多重要細胞信號轉導通路的交匯點之一[1]。研究發現，解聚素-金屬蛋白酶17(ADAM17)對Notch信號途徑的激活和轉錄具有促進作用[2]。在Notch受體家族中，Notch1受體與腫瘤的關系最受人們關注，其介導的Notch1信號通路幾乎與所有類型的惡性腫瘤有關。既往研究發現，ADAM17可促進乳腺癌細胞增殖、浸潤和轉移[3～5]，但ADAM17和Notch1在乳腺癌組織中的表達變化及其與患者臨床病理特征的關系鮮見報道。為此我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2013年12月華北理工大學附屬醫院病理科保存的正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤性乳腺癌組織石蠟標本各30例份(分別簡稱為正常乳腺標本、乳腺纖維腺瘤標本及乳腺癌標本)，2013年6月～2014年12月華北理工大學附屬醫院于-70 ℃保存的新鮮正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及浸潤性乳腺癌組織各10例份(分別簡稱為正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織)。采集標本者均為女性，具有完整的臨床資料；浸潤性乳腺癌患者均為首次發病，術前均未行放、化療或其他抗腫瘤治療，術后均經病理確診。不同組織患者年齡具有可比性。

1.2 ADAM17和Notch1蛋白表達檢測 ①正常乳腺標本、乳腺纖維腺瘤標本及乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白檢測采用免疫組化法。將不同組織石蠟切片經脫蠟、高壓抗原修復后，3% H2O2室溫浸泡30 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。血清封閉后滴加抗ADAM17、抗Notch1的一抗(1∶100稀釋)，置于4 ℃ 冰箱過夜。次日PBS沖洗，滴加二抗，孵育30 min，PBS沖洗，滴加DAB顯色液。用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。ADAM17定位于細胞質，Notch1定位于細胞膜和細胞質。染色指數以染色強度評分與陽性細胞比例評分的乘積表示。染色強度評分：細胞無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分：陰性為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色指數>3定義為陽性，計算陽性表達率。分析浸潤性乳腺癌組織ADAM17和Notch1蛋白陽性表達率的關系。②正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織ADAM17和Notch1蛋白檢測采用Western blotting法。將凍存的不同組織冰上解凍，經組織裂解液制成勻漿，提取細胞總蛋白。取50 μg蛋白100 ℃變性5 min，5%濃縮膠電泳后，轉至醋酸纖維素(PVDF)膜。TBST漂洗PVDF膜3次，封閉液中孵育1 h，分別加入兔抗人ADAM17、兔抗人Notch1抗體(1∶1 000稀釋)及GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。TBST沖洗，二抗室溫震蕩孵育1 h，TBST洗滌后，DAB顯色。以GAPDH為參照，采用Image J圖像分析系統分析PVDF中蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值計算蛋白相對表達量。

1.3 乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 記錄浸潤性乳腺癌患者的年齡、腫瘤直徑和腋窩淋巴結轉移情況，分析其與乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白表達的關系。

2 結果

2.1 ADAM17和Notch1蛋白表達情況 正常乳腺標本、乳腺纖維腺瘤標本及乳腺癌標本ADAM17染色指數分別為1.03±0.38、2.03±0.48、7.31±2.58，Notch1染色指數分別為0.59±0.20、2.38±0.53、6.41±1.88；三種標本中ADAM17和Notch1染色指數均依次升高(P<0.05或<0.01)。正常乳腺標本、乳腺纖維腺瘤標本及乳腺癌標本ADAM17蛋白陽性表達率分別為3.3%(1/30)、10.0%(3/30)、83.3%(25/30)，Notch1蛋白陽性表達率分別為0、6.7%(2/30)、76.7%(23/30)；乳腺癌標本ADAM17、Notch1陽性表達率均高于正常乳腺標本、乳腺纖維腺瘤標本(P<0.05)。乳腺癌標本ADAM17和Notch1雙陰性表達率為10.0%(3/30)，雙陽性表達率為70.0%(21/30)，二者陽性表達率呈正相關(r=0.504，P<0.05)。②正常乳腺組織、乳腺纖維腺瘤組織及乳腺癌組織ADAM17蛋白相對表達量分別為0.27±0.05、0.37±0.06、0.78±0.10，Notch1蛋白相對表達量分別為0.15±0.04、0.32±0.05、0.45±0.07；三種組織中ADAM17和Notch1蛋白相對表達量依次升高(P<0.05或<0.01)。

2.2 乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白陽性表達率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關(P均>0.05)，均與腋窩淋巴結轉移有關(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 乳腺癌標本ADAM17和Notch1蛋白表達 與患者臨床病理特征的關系

3 討論

ADAM是一類具有多種生物學功能的細胞膜表面糖蛋白家族，也是鋅離子依賴的金屬蛋白酶家族，目前已經有40多個家族成員相繼被發現。ADAM17是其中研究較廣泛的重要成員之一，因其具有水解TNF-ɑ的作用又稱TNF-ɑ轉化酶[6]。ADAM17具有蛋白剪切酶樣作用，通過剪切活化雙調蛋白、轉化生長因子、表皮生長因子等重要的受體配體，從而激活相應的信號轉導通路，調節細胞的生物學活性[7]。ADAM17可通過不同的途徑促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，正常狀態下在哺乳動物的多種細胞中廣泛表達，但表達量較少；而在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態，因此有一定的腫瘤特異性[7]。研究顯示，卵巢癌、胃癌及胰腺癌組織ADAM17表達升高[8～10]；ADAM17在乳腺癌組織表達升高，與乳腺癌的惡性程度、臨床分期和淋巴結轉移密切相關[4，11,12]。特異性ADAM17小干擾RNA可以有效沉默ADAM17在乳腺癌細胞中的表達，使乳腺癌細胞的增殖能力明顯下降[5]。

目前已在哺乳動物中發現4種Notch基因，分別命名為Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。Notch信號轉導主要發生在細胞間，是介導細胞和細胞之間直接接觸的信號通路之一，可以調控細胞的增殖、分化和凋亡。在Notch受體家族中，Notch1受體與腫瘤的關系最受關注，但活化形式不同的Notch1對腫瘤的調節作用不一致，且即使在同一種腫瘤，隨著腫瘤發展階段的不同，Notch1信號通路的作用也可不一致。Notch1在結腸癌組織中呈高表達，與腫瘤病理分型、病程和淋巴結轉移呈正相關，提示Notch1在結腸癌的發生、發展中發揮重要作用[13]。研究顯示，Notch1在非小細胞肺癌、胃癌及卵巢上皮性癌組織中表達明顯升高[14～16]。

本研究免疫組化法和Western blotting法檢測結果均顯示，正常乳腺、乳腺纖維腺瘤及乳腺癌組織和標本中ADAM17、Notch1蛋白表達均依次升高；同時乳腺癌標本ADAM17、Notch1蛋白陽性表達率均與患者的年齡、腫瘤直徑無關，與腋窩淋巴結轉移有關。說明浸潤性乳腺癌標本ADAM17、Notch1蛋白表達升高，提示患者預后不良。ADAM17與Notch1受體活化及隨后的Notch1信號通路激活密切相關，ADAM17蛋白可通過激活Notch1受體引發Notch1信號通路的激活[17，18]。本研究中，乳腺癌標本ADAM17和Notch1雙陰性表達率為10.0%，雙陽性表達率為70.0%，二者陽性表達率呈顯著正相關。證實了ADAM17蛋白可以促進Notch1信號途徑的活化，但活化的ADAM17蛋白是通過水解Notch1受體配體、促進配體與受體的結合而啟動Notch1信號途徑，還是直接水解Notch1受體激活Notch1通路，仍需進一步研究。

綜上所述，浸潤性乳腺癌組織中 ADAM17和Notch1蛋白表達升高，其異常表達可能促進腫瘤淋巴結轉移。

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河北省自然科學基金面上項目(C2010001767)；唐山市科學技術研究與發展計劃項目(14130256B)。

張雪鵬(E-mail： syzxp@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.025

R737.9

B

1002-266X(2016)32-0071-03

2015-12-20)