2型糖尿病患者Klotho基因G-395A多態性及其對合并下肢動脈粥樣硬化的影響

趙燕，宋滇平，王艷，王玲，劉華，楊秋萍

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

2型糖尿病患者Klotho基因G-395A多態性及其對合并下肢動脈粥樣硬化的影響

趙燕，宋滇平，王艷，王玲，劉華，楊秋萍

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

目的 觀察2型糖尿病(T2DM)患者Klotho基因G-395A多態性，探討其對合并下肢動脈粥樣硬化的影響。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)技術，分別對205例健康體檢者(漢族85例、彝族120例，對照組)、140例T2DM患者(漢族79例、彝族61例，T2DM組)及224例T2DM合并下肢動脈粥樣硬化患者(漢族157例、彝族67例，動脈硬化組)的Klotho基因G-395A多態性進行檢測，比較各組漢族、彝族基因型頻率、等位基因頻率，分析T2DM合并下肢動脈粥樣硬化的危險因素。結果 動脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型頻率高于彝族(P<0.05)，其余各組各等位基因及基因型頻率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。漢族T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化的影響因素為SBP、TG、LHL、空腹血糖(FPG)、Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族為TG、LHL、FPG、血肌酐(P均<0.05)。結論 T2DM合并下肢動脈粥樣硬化患者存在Klotho基因G-395A多態性，Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型可能是云南省漢族部分T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化的危險因素。

2型糖尿病；下肢動脈粥樣硬化；Klotho基因；彝族；漢族；單核苷酸多態性

大血管病變是糖尿病的主要并發癥之一，它是糖尿病致死的最主要原因。糖尿病大血管病變主要累及主動脈、冠狀動脈、腦動脈和外周血管等，病理基礎為動脈粥樣硬化。Klotho基因是1997年日本學者 Kuro-O等[1]發現的、與衰老有關的基因，該基因缺陷可引起小鼠動脈硬化、骨質疏松、皮膚萎縮及肺氣腫等疾病。Klotho基因變異在2型糖尿病(T2DM)及動脈粥樣硬化發生、發展過程中發揮重要作用。彝族是云南省人口最多的少數民族之一，由于地理、歷史和社會等原因，已形成獨特的遺傳隔離人群，有利于進行隔離人群遺傳特點研究。目前尚未見對云南彝族Klotho基因G-395A多態性的相關研究。本研究觀察T2DM患者Klotho基因G-395A多態性，探討其對合并動脈粥樣硬化的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年10月～2010年4月在昆明醫科大學第一附屬醫院及楚雄州醫院收治的單純T2DM患者140例(T2DM組)，男86例、女54例，漢族79例、彝族61例，糖尿病病程(35.50±25.17)個月。T2DM合并下肢動脈硬化患者224例(動脈硬化組)，男116例、女108例，漢族157例、彝族67例，糖尿病病程(51.80±43.79)個月。T2DM診斷和分型均參照1999年WHO推薦標準；彩色多普勒超聲顯示股動脈內膜-中膜厚度(IMT)≥1.0 mm、局部有斑塊或管腔狹窄診斷為下肢動脈粥樣硬化。選擇體檢健康者205例為對照組，男124例、女81例，漢族85例、彝族120例，無糖尿病、高血壓家族史。研究對象均為長期定居云南省昆明市、楚雄市，居住滿20年，三代無外族通婚且相互間無血緣關系的漢族、彝族居民。三組性別、民族、糖尿病病程比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，其余臨床資料比較見表1。

表1 三組一般臨床資料比較

注：BUN為尿素氮，Scr為血肌酐，FPG為空腹血糖；與對照組比較，aP<0.05；與T2DM組比較，bP<0.05。

1.2 Klotho基因G-395A多態性檢測 研究對象均禁食12 h，取空腹肘靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管中室溫放置30 min，分離血細胞、提取DNA。采用上海華舜生物技術有限公司柱式小量血液DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)技術中的TaqMan熒光探針法檢測G-395A(rs1207568)基因分型。將選定的G-395A(rs1207568)多態性位點在Applied Biosystems公司網站上查找相應的TaqMan-MGB探針，將探針標號及多態性位點一起送至Applied Biosystems公司合成引物及探針，按照其建議的PCR反應體系和反應條件進行檢測。反應體系：20×引物及熒光探針混合溶液 0.5 μL，2×TaqMan通用PCR擴增預混試劑7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，DNA模板1.5 μL，滅菌蒸餾水5.2 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環，最后72 ℃保溫10 min。使用ABI Prism7300型熒光定量PCR擴增儀，按上述PCR反應體系和反應條件設定擴增程序后執行，擴增完成后根據FAM和VIC熒光信號的反應曲線，對未知樣本進行G-395A基因型分析，分別選取不同基因型送至上海生工生物技術有限公司測序，并將測序結果與Klotho基因序列進行Blast比對。采用基因計數法計算各組基因型頻率及等位基因頻率。

2 結果

2.1 測序結果 G-395A位點存在3種基因型，分別為GG、GA、AA基因型。測序結果與FQ-PCR技術的基因分型結果一致，與Blast比對后顯示一致。見圖1。

2.2 各組彝族、漢族G-395A的基因型分布及等位基因頻率比較 彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因頻率分別為83.9%和16.1%，漢族人群分別為81.8%和82.0%。對照組及T2DM組Klotho基因G-395A位點基因型及等位基因頻率分布在彝族、漢族之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；動脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型頻率高于彝族(P<0.05)，但二者等位基因頻率比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

注：A、B、C箭頭分別對應GG、GA、AA基因型。

圖1 G-395A位點3種基因型測序結果

表2 各組彝族、漢族G-395A基因型及等位基因分布[例(%)]

注：AA型的期望頻數<5，合并至GA型；與同組漢族比較，*P<0.05。

2.3 T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化的影響因素 分別在漢族、彝族人群中，以糖尿病合并下肢動脈粥樣硬化發生與否作為因變量，選擇表1中兩組之間有統計學差異的基本資料及Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型為自變量，進行多因素Logistic多元回歸分析，結果顯示漢族T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化的影響因素為SBP、TG、LHL、FPG、Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族為TG、LHL、FPG、Scr(P均<0.05)。見表3、4。

表3 漢族T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化影響因素的多元Logistic回歸分析結果

3 討論

糖尿病與動脈粥樣硬化的發生、發展關系密切，國外學者根據二者間的相關性提出了“共同土壤”學說，認為胰島素抵抗是導致心腦血管疾病代謝異常的根本原因。近年來隨著對 Kotho基因研究的深入，發現Kotho基因不僅是衰老相關性基因，與衰老相關病理改變聯系密切；同時，其通過相關分子機制對個體多種代謝進行干預，參與冠心病、糖尿病等疾病的發生、發展。Klotho基因長50 kb，由5個外顯子和4個內含子組成，在人和小鼠中均定位于第13號染色體(13q12)，大鼠中定位于第12號染色體(12q12)。Klotho基因可通過調節某些離子通道、胰島素樣生長因子1(IGF-1)受體等細胞表面糖蛋白的活性而發揮作用。Klotho基因缺陷小鼠在出生4周后即可出現動脈硬化，并隨鼠齡增加而加重，表現為主動脈嚴重鈣化，肌性中動脈中層鈣化、內膜增厚、腎臟小動脈嚴重鈣化等，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似；將外源性正常Klotho基因cDNA轉導給Klotho缺陷小鼠，其動脈硬化程度可得到顯著改善[1]。除對Klotho缺陷小鼠進行基因補救有效外，對存在多種動脈硬化危險因素的自發性T2DM大鼠導入Klotho基因同樣可以改善內皮細胞功能，增加內皮細胞NO合成，減輕血管周圍組織纖維化、逆轉血管重塑、降低血壓，對減輕動脈硬化具有重要作用[2]。Klotho基因在胰島素和IGF-1信號通路中發揮重要調節作用。國內研究顯示，T2DM患者血漿Klotho水平低于正常對照者，且胰島素敏感指數是血漿Klotho水平的獨立影響因素，提示Klotho基因可能參與胰島素抵抗和T2DM的發生、發展，機制考慮為Klotho參與抗氧化應激、抗凋亡、改善內皮功能等[3]。

表4 彝族T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化影響因素的多元Logistic回歸分析結果

Klotho基因含有400多個單核苷酸多態性位點，人類Klotho 基因多個多態性位點與動脈硬化性疾病相關，如Kl-VS等位基因、G-395A多態性、C1818T多態性等[4,5]。其中G-395A位于啟動子區，Klotho基因G-395A多態性可影響啟動子的轉錄過程，電泳遷移率變動分析(EMSA)顯示，由G等位基因形成的DNA蛋白復合物的量明顯高于由A等位基因形成的量，提示G突變為A可能通過減少蛋白和啟動子的結合而影響Klotho基因的功能[6]。近年來研究發現，G-395A位點可影響冠心病、血管性卒中、血脂異常、糖尿病、骨質疏松、胃癌等疾病的危險性[5,7,8]，是重要的遺傳篩選標記及潛在的功能性多態性位點。

本研究的研究對象均為長期定居云南省昆明市、楚雄市，居住滿20年，三代無族外通婚且相互間無血緣關系的漢族、彝族居民。結果顯示，彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因頻率分別為83.9%和16.1%，漢族人群分別為81.8%和82.0%，與韓國、日本人群接近[5,9]。動脈硬化組漢族Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型頻率高于彝族，提示漢族、彝族存在Klotho基因G-395A多態性；多元回歸分析顯示，漢族人群中糖尿病下肢動脈粥樣硬化的發生與SBP、TG、LDL、FPG、Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型相關，彝族人群則與FPG、TG、LDL、Scr相關。T2DM患者由于高血糖的長期刺激可導致其血糖、血脂、肝腎功能發生病理損傷，影響內皮細胞功能，促進下肢動脈血栓的形成。Klotho基因與T2DM患者發生動脈粥樣硬化之間的關系復雜，目前認為Klotho基因減輕動脈粥樣硬化的機制可能包括：①增加NO的合成。Klotho基因缺陷小鼠血管內皮細胞NO合成明顯下降，經過與野生型小鼠進行聯體結合后其NO合成可得到明顯改善[10]。NO是擴張血管的主要化合物，可抑制血管平滑肌細胞增生，保護內皮細胞。②抑制p53/p21表達，保護內皮細胞[11]。p53/p21是衰老促進基因，對其抑制可以減緩內皮細胞衰老的進程。③促進新生血管形成。研究顯示，Klotho基因敲除小鼠血管生成受到抑制[12]。Klotho基因敲除可引起骨質疏松、骨髓抑制等骨髓微環境改變，導致內皮前體細胞生成減少，其分化及遷移功能受損，抑制新生血管生成，促進動脈粥樣硬化的發生、發展[11,13]。

綜上所述，云南省漢族、彝族部分T2DM合并下肢動脈粥樣硬化患者存在Klotho基因G-395A多態性，Klotho基因G-395A位點GA+AA基因型可能是漢族T2DM患者發生下肢動脈粥樣硬化的危險因素。

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G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus patients and its influence on combined lower limb atherosclerosis

ZHAOYan,SONGDianping,WANGYan,WANGLing,LIUHua,YANGQiuping

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650032,China)

Objective To observe the G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients, and to investigate its influence on combined lower limb atherosclerosis. Methods The G-395A polymorphisms of Klotho gene from 205 cases of normal controls (85 cases of Han nationality, 120 cases of Yi nationality, control group), 140 cases of T2DM patients (79 cases of Han nationality, 61 cases of Yi nationality, T2DM group) and 224 cases of patients with lower limb atherosclerosis combined with T2DM (157 cases of Han nationality, 67 cases of Yi nationality, atherosclerosis group) were detected by real-time fluorescence quantification PCR (FQ-PCR). The genotype frequency and allele frequency were compared between each group, and the risk factors of T2DM combined with lower limb atherosclerosis were analyzed. Results The genotype frequency of Klotho gene G-395A site G/A+A/A in the atherosclerosis group of Han nationality was higher than that of Yi nationality (P<0.05). There was no significant difference in genotype and allele frequency among the rest groups (allP>0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Han nationality were systolic blood pressure, TG, LHL, fasting blood-glucose (FPG) and genotype of Klotho gene G-395A site G/A+A/A (allP<0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Yi nationality were TG, LHL, FPG and serum creatinine (allP<0.05). Conclusions There is gene polymorphism at G-395A of Klotho gene in T2DM patients with lower limb atherosclerosis. The Klotho gene G-395A site G/A+A/A genotype may be a genetic risk factor for the occurrence of lower limb atherosclerosis of T2DM patients in Han nationality.

diabetes mellitus, type 2; lower limb atherosclerosis; Klotho gene; Yi nationality; Han nationality; single nucleotide polymorphisms

云南省自然科學基金資助項目(2009CD166)。

趙燕(1979-)，女，主治醫師，研究方向為糖尿病及其慢性并發癥的診治。E-mail: yanny8080@sohu.com

楊秋萍(1964-)，女，主任醫師，研究方向為內分泌與代謝性疾病的診治。E-mail: yqp22@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.004

R587.1

A

1002-266X(2016)28-0012-04

2015-12-01)