回族Lynch綜合征一家系錯配修復基因表達及突變情況分析

解澎，任景麗，汪文杰，虎建恩，胡桂明，吳會芳，牛海鷗

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

回族Lynch綜合征一家系錯配修復基因表達及突變情況分析

解澎，任景麗，汪文杰，虎建恩，胡桂明，吳會芳，牛海鷗

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

目的 分析回族Lynch綜合征一家系錯配修復基因(MMR)表達及突變情況，探討回族Lynch綜合征的基因特點。方法 先證者男性，37歲，第4代，回族，直腸低分化腺癌。本家系現存6代(均為回族)，共有結直腸癌患者14例，在世7例。提取本家系中6例患者及5例正常人外周血及腫瘤組織DNA。采用DNA測序檢測腫瘤細胞DNA微衛星不穩定性(MSI)，采用免疫組化法檢測腫瘤細胞MMR表達，采用PCR技術檢測MMR基因突變情況。結果 該家系結直腸癌患者腫瘤組織MSI檢測均表現為高度微衛星不穩定性(MSI-H)；腫瘤組織MMR家族中MLH1表達均為陰性；MLH1基因第一外顯子存在2個新的錯義突變位點c.264G>T、c.265G>T，其中c.265G>T突變導致MLH1基因蛋白質翻譯在該位點提前終止。結論 回族Lynch綜合征家系存在MLH1基因突變，即存在第一外顯子錯義突變位點c.265G>T。

Lynch綜合征；結直腸腫瘤；錯配修復基因；微衛星不穩定性；回族

Lynch綜合征為常染色體顯性遺傳疾病，發病率占所有結直腸癌的2%～3%[1]，其主要發病機制為錯配修復基因(MMR)突變導致的DNA錯配修復功能障礙。Lynch等[1]最早確定MMR基因為癌癥的易感基因，隨后越來越多的錯配修復家族基因被發現，目前報道的主要有MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2等[2]。我國對Lynch綜合征的研究起步較晚，針對少數民族家系的研究更少。本課題組在臨床工作中發現1個回族Lynch綜合征家系，現對該家系的基因情況進行分析，探討其基因特點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者(第4代，Ⅳ8)，男性，37歲，回族，腸鏡檢查見距肛門8～13 cm直腸左前壁有一菜花樣腫物。術后病理診斷為直腸低分化腺癌。本家系現存6代(均為回族)，共有結直腸癌患者14例，其中結腸癌12例，直腸癌3例(1例為直腸癌術后患結腸癌)。至2016年1月尚在世7例；結腸癌發病部位均為右半結腸，病理診斷為管狀腺癌或黏液腺癌，組織分化程度均較低，無原位癌。均行右端結腸切除術，術后均行常規化療。家系中存在3例患者互為1級親屬的現象。家族中連續3代均有發病。該家系符合Amsterdam標準。其中1例因年齡大、身體狀況極差未納入本研究，余6例患者的家系位置及臨床資料見表1。

表1 6例結直腸癌患者的基本資料

注：*為先證者；Ⅲ為第三代，Ⅳ為第四代。

1.2 外周血及腫瘤組織DNA提取 取本家系中6例患者及5例正常人的外周血，采用QIAGEN公司全血DNA提取試劑盒提取外周血DNA，置于-20 ℃冰箱保存。隨機選取其中3例患者(Ⅳ1、Ⅳ8、Ⅳ15)既往手術所取的腫瘤石蠟包埋組織，采用QIAGEN公司石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取DNA，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 腫瘤組織微衛星不穩定性(MSI)檢測 選取1.2所提DNA作為檢測樣本，采用直接測序法檢測DNA微衛星標記序列是否與UCSC數據庫人類基因組序列一致。依照美國國立癌癥研究所推薦的判定標準選取5個檢測位點，分別為BAT25、BAT26、D5S346、D2S123、D17S150。判定標準：≥2個位點不穩定判定為高度微衛星不穩定(MSI-H)，1個位點不穩定判定為低度微衛星不穩定(MSI-L)，5個位點均穩定判定為微衛星穩定(MSS)。測序分析結果顯示，3例患者腫瘤組織DNA均表現為MSI-H。

1.4 腫瘤組織MMR表達檢測 取1.2中3例患者石蠟包埋腫瘤組織，并以遠離腫瘤的切緣結腸組織(距腫瘤5 cm以上)作為對照，采用免疫組化法檢測腫瘤組織中MLH1、MSH2及MSH6表達。采用半定量評估法判定結果。對染色深度和陽性細胞百分率分別計分：無染色為0分，弱染色為1分，中等強染色為2分，強染色為3分；陽性細胞比例<1%為0分，1%～10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～80%為3分，>80%為4分。染色強度和陽性細胞率之和為0～2分為陰性，3～5分為陽性，6～7分為強陽性。結果顯示，3例患者腫瘤組織MLH1表達均陰性，MSH2及MSH6表達均陽性。

1.5 MMR突變檢測 1.3結果顯示3例患者腫瘤組織中MLH1基因表達均缺陷，故對MLH1基因19個外顯子進行測序。選取家系先證者全血DNA為樣本，應用Primer Premier5.0軟件設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用PCR反應試劑盒對MLH1基因外顯子區域進行PCR擴增，反應產物經瓊脂糖凝膠電泳并測序。測序結果對比采用SeqMan軟件。

該家系先證者外周血DNA在MLH1基因1號外顯子上發現有2個突變位點，分別為c.264G>T、c.265G>T，其余外顯子未發現突變。在NCBI SNP數據庫中未查到上述位點已知的SNP。根據突變序列翻譯出氨基酸序列在NCBI Protein Blast數據庫中與常見的幾種動物氨基酸進行特異性對比，發現這些動物在該位點氨基酸序列與野生型一致，推測該位點所在序列可能為保守序列，即c.264G>T突變為同義突變，不對氨基酸序列產生影響，而c.265G>T可導致MLH1基因序列翻譯在第22位提前終止。采用Polyphen進行蛋白功能預測，預測結果顯示此突變為有害突變。推測c.265G>T突變由于提前終止氨基酸序列翻譯從而使蛋白質功能喪失。

1.6 突變位點家系內驗證 參照1.5方法再次檢測該家系內5例患者及另外5例正常個體外周血MLH1基因1號外顯子突變情況，反應體系及條件均同1.5。結果顯示，5例患者均存在c.265G>T突變，正常個體中4例未發現突變、1例發現相同突變。見圖1。

注：A為結直腸癌患者，B為正常人；箭頭所指為MLH1基因1號外顯子c.265G>T突變。

圖1 家系內結直腸癌患者及正常人MLH1基因1號外顯子測序圖

2 討論

目前對Lynch綜合征主要依靠基因檢測結合臨床診斷[3，4]。2015年美國臨床腫瘤學會(ASCO)指出，疑似Lynch綜合征患者均應進行MMR蛋白免疫組化檢測或MSI分析，若MMR蛋白缺失或MSI-H，則應排除BRAF V600E突變和MLH1啟動子甲基化因素，而后進行MMR基因種系突變檢測[5]。

微衛星是指基因組內短序列的重復單元，在DNA復制過程中易發生錯誤[6]。MSI檢測是目前Lynch綜合征的初篩手段之一[7]，對Lynch綜合征患者選擇化療方案和判斷預后亦有一定的指導意義[8]。研究表明，處于Ⅱ期MSI-H的Lynch綜合征患者不能從5-氟尿嘧啶輔助化療中獲益，該化療方案會降低患者的生活質量[9]。

MLH1基因是Lynch綜合征中突變率最高的MMR基因[10]，定位于3p21.3～23，含有19個外顯子，編碼蛋白含756個氨基酸，通常與其他MMR基因組成復合體發揮作用[11]。李曉芬等[12]統計分析了國內近年來報道的Lynch家系基因突變情況，在檢出MMR種系突變的141個Lynch綜合征家系中，MLH1種系突變75個(53.2%)。不同的MMR基因突變所表現的發病特點并不完全相同。Vasen等[13]研究表明，MSH2突變基因攜帶者罹患子宮內膜癌的風險(61%)比MLH1突變基因攜帶者(42%)高。

我國是多民族國家，但針對少數民族Lynch綜合征的研究較少。珠珠等[11]研究了云南地區7個Lynch綜合征家系，7個家系均存在MMR基因缺失，其中3個漢族家系檢出已知致病突變，但在4個少數民族家系中未檢測出包括大片段缺失及基因重排在內的致病突變；提示結直腸癌患者的MMR基因表達以及MMR基因突變可能存在民族差異。

本研究報道的Lynch綜合征家系包括6代，均為回族，先證者以結腸癌入院，既往有直腸癌病史，采集信息發現高度聚集的癌癥家族史，為明確診斷進行MMR蛋白檢測，發現腫瘤組織MLH1表達缺失，繼而對家系內患者及部分未患病者進行MMR蛋白及基因檢測，發現致病突變，即MLH1基因第一外顯子錯義突變位點c.265G>T。家系內1例未患病成員基因序列存在與患者相同突變，該成員年齡較小(17歲)，推測為致病基因突變攜帶者，其患腫瘤風險較高，應密切監測，定期體檢。本家系患者腫瘤組織DNA表現為MSI-H，為錯配修復功能缺陷導致基因在復制過程中的錯誤得不到有效修復，繼而在微衛星位點上出現不同于野生型的表型。

總之，回族Lynch綜合征家系存在MLH1基因突變，即存在第一外顯子錯義突變位點c.265G>T；該發現為我國少數民族Lynch綜合征基因突變研究增加了新的數據支持。

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Pedigree analysis and gene mutation inspection of Lynch syndrome in Hui nationality

XIEPeng,RENJingli,WANGWenjie,HUJian′en,HUGuiming,WUHuifang,NIUHaiou

(1TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Objective To investigate the expression and mutations of DNA mismatch repair (MMR) of Lynch syndrome in the members of a Chinese Hui family. Methods The propositus was male, 37 years old, the forth generation, Hui nationality, had rectal poorly differentiated adenocarcinoma. There were six generations existing (Hui nationality), and a total of 14 patients with colorectal cancer were found including 7 living cases. The peripheral blood and tumor tissue DNA was collected from 6 cases of patients and 5 healthy controls. The microsatellite instability (MSI) was detected through DNA sequencing, the expression of MMR protein was measured using immunohistochemistry, and MMR gene mutations was detected by PCR amplification. Results The MSI detection of tumor tissues in the family members demonstrated MSI-H. The immunohistochemistry showed that MLH1 protein was negative. Two new missense mutation sites (c.264G>T and c.265G>T) in the first exon of MLH1 gene were found in 6 patients and 1 normal individual, and c.264G>T mutation led to early termination of MLH1 protein translation on this site. Conclusion There is MLH1 mutation in Hui family with Lynch syndrome, that is the missense muntation site c.264G>T in the first exon of MLH1 gene.

Lynch syndrome; colorectal neoplasms; DNA mismatch repair; microsatellite instability; Hui nationality

河南省醫學科技攻關計劃項目(201503099)。

解澎(1988-)，男，碩士在讀，研究方向為消化系統腫瘤發病機制。E-mail: 18239980973@163.com

任景麗(1964-)女，副主任醫師，副教授，研究方向為消化系統腫瘤發病機制。E-mail: jingliren123002@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.005

R735.3

A

1002-266X(2016)28-0016-03

2016-01-25)