人SND1基因慢病毒載體構建及穩定表達SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細胞株篩選

任媛媛，雷靜，趙然，辛靈彪，蘇超，高星杰，楊潔

(天津醫科大學,天津300070)

·論著·

人SND1基因慢病毒載體構建及穩定表達SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細胞株篩選

任媛媛，雷靜，趙然，辛靈彪，蘇超，高星杰，楊潔

(天津醫科大學,天津300070)

目的 構建人SND1基因慢病毒載體，篩選穩定表達SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細胞株，為探討SND1基因對卵巢癌的調控作用提供細胞系模型。方法 采用PCR法從pCMV-FLAG-SND1質粒中擴增FLAG-SND1基因片段，連接到慢病毒載體表達質粒pLVX-IRES-Hyg中，獲得重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1。以pLVX-FLAG-SND1瞬時轉染293T細胞48 h，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達量。pLVX-FLAG-SND1重組質粒通過與包裝質粒共轉染293T細胞，獲得攜帶FLAG-SND1的重組慢病毒。以慢病毒感染SKOV3細胞48 h，在細胞培養基中加入1 μg/mL 潮霉素B，篩選穩定表達SND1蛋白的細胞株，采用Western blotting法檢測該細胞株內SND1蛋白表達量。結果 重組慢病毒載體經雙酶切和基因測序比對鑒定正確。重組慢病毒載體在瞬時轉染的293T細胞中SND1蛋白表達量高于野生型SKOV3細胞(P<0.01)。SKOV3細胞經慢病毒感染、藥物篩選后獲得的穩定表達株中SND1蛋白表達量高于野生型SKOV3細胞(P<0.01)。結論 成功構建了SND1基因慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1，并篩選出穩定表達SND1蛋白的SKOV3細胞株，為進一步明確卵巢癌發生、發展機制奠定了基礎。

SND1基因；慢病毒載體；SKOV3細胞；卵巢癌

人類SND1蛋白又稱p100或Tudor-SN，是一種在真核細胞中廣泛表達、偶聯轉錄調控和剪接的多功能蛋白，參與基因轉錄、RNA干擾、pre-mRNA剪切等多種生物學過程，在細胞增殖、凋亡、應激及脂肪代謝等多種生理過程中發揮重要調控作用[1～4]。SND1蛋白在乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中發揮促癌作用，其過表達可能是導致惡性腫瘤發生、發展的重要原因[5～7]。但SND1與卵巢癌發生、發展的關系尚不明確。2015年8～12月，本研究構建了SND1基因慢病毒載體，包裝病毒后感染并篩選穩定表達SND1蛋白的人卵巢癌SKOV3細胞株，為進一步探討SND1在卵巢癌中的作用提供體外細胞系模型。現將研究過程及結果報告如下。

1 材料、方法與結果

1.1 材料 人卵巢癌SKOV3、293T細胞系、pCMV-FLAG-SND1質粒均為本實驗室保存。慢病毒載體質粒pLVX-IRES-Hyg、包裝質粒1和包裝質粒2由天津醫科大學生物化學與分子生物學系石磊教授饋贈。大腸桿菌DH5α感受態、Trans2K PlusⅡ DNA Marker、Trans 15K DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。氨芐青霉素和潮霉素B購自羅氏公司。轉染試劑Polyethyleneimine購自Sigma公司。DreamTaqGreen PCR Master Mix(2X)、Xba1和Not1限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。引物合成和基因測序均由上海Invitrogen公司完成。小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司。質粒快速小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。去內毒素質粒抽提試劑盒購自Omega公司。鼠源SND1單克隆抗體由本實驗室制備。鼠源FLAG M2抗體購自Sigma公司。辣根過氧化氫酶標抗鼠IgG購自KPL公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce公司。ECL Western blotting試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 潮霉素B最低致死濃度測定 將SKOV3細胞按3×105/孔接種于24孔板，用含10% FBS的McCOY 5A培養基常規培養24 h，分別加入0、0.5、1、1.25、1.5 μg/mL 潮霉素B培養3天，結果顯示加入1、1.25、1.5 μg/mL潮霉素B的全培養基培養的SKOV3細胞全部死亡，加入0.5 μg/mL潮霉素B的全培養基培養的SKOV3細胞部分死亡，由此確定潮霉素 B對SKOV3細胞的最低致死濃度為1 μg/mL，后續研究選擇1 μg/mL 潮霉素 B進行抗藥篩選。

1.3 重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1的構建與鑒定 設計FLAG-SND1基因的PCR引物，在兩條引物中分別引入Xba1、Not1限制性酶切位點。上游引物為5′-GCTCTAGAATGGATTACAAGGATGACG-ACG-3′，下游引物為5′-TTGCGGCCGCTTAGCGGCTGTAGCCAAATT-3′。PCR反應體系參照說明書，退火溫度為60 ℃，從pCMV-FLAG-SND1質粒中克隆完整的FLAG-SND1片段，所得PCR產物大小為2 798 bp。PCR產物及pLVX-IRES-Hyg慢病毒載體同時采用Xba1、Not1雙酶切，電泳后回收純化線性的酶切產物。用T4 DNA連接酶將線性化的慢病毒載體與FLAG-SND1片段進行16 ℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，在具有氨芐青霉素抗性的LB平板上篩選出16個陽性單克隆，編號1～16，進行菌落PCR鑒定，并挑取鑒定陽性的單克隆搖菌擴大培養，采用去內毒素質粒小提試劑盒提取重組質粒(按試劑盒說明書操作)；采用FLAG-SND1引物進行質粒PCR，PCR產物大小為2 798 bp。采用Xba1、Not1雙酶切鑒定重組質粒，兩條條帶分子量分別在9 000 bp和3 000 bp左右為初步鑒定正確的質粒；若顯示一條條帶則為未切開或未連接成功的質粒。將雙酶切鑒定正確的質粒進行DNA測序，進一步鑒定插入序列的準確性。

電泳結果顯示，第3、4、8、11、12、13、16條帶位于3 000 bp左右，大小與預期相符，證明轉化成功，見圖1。選取3、4、8、11、12、13號單克隆擴大培養后提取質粒進行Xba1和Not1雙酶切，電泳結果顯示8、11、12、13號菌液提取質粒經雙酶切得到兩條條帶，分別在9 000 bp左右和3 000 bp左右，初步鑒定質粒正確；4號菌液提取質粒經雙酶切僅顯示一條9 000 bp左右的條帶，說明未連接成功；3號菌液提取質粒電泳結果條帶不明顯，質粒抽提失敗；見圖2。隨機選取8、11號菌液提取質粒，采用FLAG-SND1引物進行PCR擴增，產物電泳條帶均位于3 000 bp左右，與預期相符，見圖3。重組質粒基因測序結果經序列比鑒定正確，證實FLAG-SND1序列已正確插入pLVX-IRES-Hyg質粒，重組載體構建完成。

注：M為Trans2K PlusⅡ DNA Marker；1～16分別為1～16號陽性單克隆菌落PCR產物；+為陽性對照。

圖1 重組質粒菌落電泳圖

1.4 重組慢病毒載體SND1蛋白表達檢測 常規傳代培養293T細胞，待細胞生長至60%左右匯合，在轉染試劑Polyethyleneimine介導下用8、11、12、13號陽性單克隆菌落重組質粒瞬時轉染293T細胞，48 h后收集蛋白，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達量，具體操作按試劑盒說明書進行。野生型293T細胞作為空白對照，瞬時轉染pCMV-FLAG-SND1質粒的293T細胞作為陽性對照。以空白對照野生型293T細胞SND1蛋白表達量為1，8、11、12、13號重組質粒SND1蛋白的相對表達量分別為15.91±0.84、15.50±0.95、16.27±0.61、15.43±0.10，陽性對照細胞的相對表達量為18.66±1.31；重組質粒及陽性對照細胞SND1蛋白的相對表達量均較空白對照細胞明顯增加(P均<0.01)；說明重組質粒LVX-FLAG-SND1在293T細胞中瞬時轉染成功。

注：M為Trans15K DNA Marker；VEC/-為環狀pLVX-IRES-Hyg載體；VEC/+為Not1/Xba1雙酶切后的線性pLVX-IRES-Hyg載體；3/-、4/-、8/-、11/-、12/-、13/-分別為3、4、8、11、12、13號陽性單克隆菌落提取的環狀pLVX-FLAG-SND1重組質粒；3/+、4/+、8/+、11/+、12/+、13/+分別為Not1/Xba1雙酶切后的線性pLVX-FLAG-SND1重組質粒。

圖2 重組質粒Not1、Xbal雙酶切產物電泳圖

注：M為Trans2K PlusⅡ DNA Marker；8/質粒、11/質粒分別為8、11號陽性單克隆菌落pLVX-FLAG-SND1重組質粒；8/PCR產物、11/PCR產物分別為 8、11號陽性單克隆菌落pLVX-FLAG-SND1重組質粒PCR產物。

圖3 重組質粒電泳圖

1.5 慢病毒質粒包裝 轉染前一天將293T細胞接種于10 cm細胞培養皿中，置于含10% FBS的高糖DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將去內毒素質粒小提試劑盒制備的重組質粒(或空載質粒)與包裝質粒1、包裝質粒2按照22.5 μg：7.9 μg：14.6 μg體系比在500 μL opti-MEM中混勻，另用500 μL opti-MEM與100 μL轉染試劑Polyethyleneimine混勻。將混有質粒的opti-MEM加入至混有Polyethyleneimine的opti-MEM中，輕彈混勻，室溫靜置5～20 min，逐滴緩慢加入到70%～80%匯合率的293T細胞中，培養24 h，收集病毒上清至離心管，4 ℃保存。更換新的完全培養基繼續培養48 h，再收集病毒上清至離心管中，4 ℃下500 g離心10 min，用0.45 μm的濾器過濾，-80 ℃長期保存用于感染。

1.6 SKOV3細胞感染、穩定株篩選及鑒定 將SKOV3細胞以1×106/孔接種于6孔板中，常規培養使其融合率達60%左右；培養第2天棄上清，分別加入第8、11號pLVX-FLAG-SND1表達載體包裝病毒液2 mL，補加200 μL FBS和12 μg polybrene，感染24 h；采用新鮮的完全培養基代替含polybrene的培養基培養48 h，加入1 μg/mL潮霉素B進行篩選。篩選過程中以不加慢病毒、只加1 μg/mL潮霉素 B的SKOV3細胞作為對照，此皿細胞全部死亡即篩選完成。篩選出的SKOV3細胞能夠持續穩定表達FLAG-SND1，即為SKOV3慢病毒穩定株。將一部分穩定株凍存保種；剩余的細胞制備成細胞裂解液，采用Western blotting法檢測SND1蛋白表達量。以野生型SKOV3細胞作為空白對照，以pCMV-FLAG-SND1質粒瞬時轉染293T細胞作為陽性對照；以空白對照細胞SND1蛋白表達量為1，8、11號重組質粒的相對表達量分別為9.62±0.40、9.96±0.89，陽性對照細胞的相對表達量為12.07±1.50；8、11號重組質粒及陽性對照細胞的相對表達量均較空白對照細胞明顯增加(P均<0.01)；證明穩定表達SND1蛋白的SKOV3細胞株構建成功。

2 討論

SND1蛋白是一種在真核細胞中廣泛表達的多功能蛋白，具有高度同源性，其分子量為100 kDa，因此又稱為p100蛋白。1995年，SND1作為EB病毒核蛋白2(EBNA2)的轉錄調控激活因子被首次發現并鑒定[8]。1997年，Callebaut等[9]發現人類Tudor-SN蛋白N端為由4個重復葡萄球菌核酸酶樣(SN-like)的SN(1～4)結構域，C端為Tudor-SN5(TSN)結構域，因此又被稱為Tudor-SN蛋白。研究發現，SND1作為轉錄共激活因子借助結構域與STAT6、c-Myb、STAT5等蛋白結合，參與基因轉錄調控，促進結合蛋白的轉錄活性。本課題組前期研究解析了SND1蛋白N端TSN結構域的晶體結構，并且證實SND1不僅參與基因轉錄調控，還可以促進剪接體裝配和pre-mRNA剪接加工過程。另外，SND1通過參與RNA誘導沉默復合體(RISC)組成來調節RISC活性，從而影響微小RNA(miRNA)介導的靶mRNA沉默[10]； SND1作為細胞內的一種多功能蛋白，在多種信號通路中發揮重要作用，參與細胞的生長、發育和癌變等過程。

目前已經發現SND1在肝癌、前列腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中表達上調，但其參與不同腫瘤發生的具體機制有所不同。在大鼠小腸隱窩上皮細胞中穩定過表達小鼠SND1，細胞間接觸抑制消失并且細胞增殖加快[11]。進一步研究發現，SND1蛋白作為RISC組成成分之一，在人類結腸癌組織中高表達，結腸癌細胞系中SND1通過影響RISC活性下調結腸腺瘤樣息肉(APC)蛋白的表達[12]。此外，在結腸癌組織中SND1及異黏蛋白(MTDH)的相互作用與結腸癌的發生、發展及預后密切相關[13]。在肝癌細胞中SND1通過調節NF-κB誘導激活miR-221進而促進腫瘤血管生成[7]。在肝癌細胞系SMMC-7721中，SND1通過調節胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)的表達促進肝癌細胞增殖。SND1協調剪接因子Sam68調控CD44基因的可變剪接，促進前列腺癌細胞增殖[14]。Ho等[15]在乳腺癌轉移模型的組織芯片中發現，隨著腫瘤侵襲、轉移能力的增強，SND1表達亦呈上升趨勢。SND1的表達受TGF-β信號通路的調控，通過上調HECT類泛素連接酶smurf-1促進乳腺癌細胞轉移[11]。但是，目前對卵巢癌的發生、發展機制缺乏足夠的認識。

慢病毒載體是以HIV-1病毒為基礎改造的病毒載體系統，對于一些難轉染的細胞，使用慢病毒載體能高效地將外源目的基因穩定整合入宿主細胞的基因組中，從而實現目的基因穩定持久性表達的目的。與真核表達質粒相比，重組慢病毒技術的轉染效率和穩定性顯著提高。本課題組前期研究構建的真核表達載體pCMV-FLAG-SND1在人卵巢癌細胞系SKOV3中轉染效率低。為了提高基因轉染效率，本研究選擇將FLAG-SND1基因插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-Hyg，構建重組慢病毒載體pLVX-FLAG-SND1，與慢病毒包裝質粒同時轉染293T細胞，在細胞中進行慢病毒包裝。用包裝好的慢病毒顆粒感染SKOV3細胞，經過潮霉素B抗性篩選，建立SKOV3慢病毒穩定株，且慢病毒毒粒感染后的SKOV3細胞中SND1穩定高表達，提示已成功運用該載體將SND1基因整合入SKOV3細胞的基因組中。SND1蛋白穩定表達的SKOV3細胞株的獲得，為從細胞與分子水平上探討SND1基因對卵巢癌細胞的調控作用及機制提供了體外細胞系模型，為進一步明確卵巢癌形成、發展及轉移機制奠定了基礎，并為卵巢癌的治療提供了新的分子靶標。

[1] Santhekadur PK, Das SK, Gredler R, et al. Multifunction protein staphylococcal nuclease domain containing 1 (SND1) promotes tumor angiogenesis in human hepatocellular carcinoma through novel pathway that involves nuclear factor kappaB and miR-221[J]. J Biol Chem, 2012,287(17):13952-13958.

[2] Tsuchiya N, Nakagama H. MicroRNA, SND1, and alterations in translational regulation in colon carcinogenesis[J]. Mutat Res, 2010,693(1-2):94-100.

[3] Gao X, Shi X, Fu X, et al. Human Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN) protein modulates the kinetics of AGTR1-3′UTR granule formation[J]. FEBS Lett, 2014,588(12):2154-2161.

[4] Duan Z, Zhao X, Fu X, et al. Tudor-SN, a novel coactivator of peroxisome proliferator-activated receptor gamma protein, is essential for adipogenesis[J]. J Biol Chem, 2014,289(12):8364-8374.

[5] Yu L, Liu X, Cui K, et al. SND1 acts downstream of TGFbeta1 and upstream of smurf1 to promote breast cancer metastasis[J]. Cancer Res, 2015,75(7):1275-1286.

[6] Yoo BK, Santhekadur PK, Gredler R, et al. Increased RNA-induced silencing complex (RISC) activity contributes to hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2011,53(5):1538-1548.

[7] Kuruma H, Kamata Y, Takahashi H, et al. Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1 as a potential tissue marker for prostate cancer[J]. Am J Pathol, 2009,174(6):2044-2050.

[8] Tong X, Drapkin R, Yalamanchili R, et al. The Epstein-Barr virus nuclear protein 2 acidic domain forms a complex with a novel cellular coactivator that can interact with TFIIE[J]. Mol Cell Biol, 1995,15(9):4735-4744.

[9] Callebaut I, Mornon JP. The human EBNA-2 coactivator p100: multidomain organization and relationship to the staphylococcal nuclease fold and to the tudor protein involved in Drosophila melanogaster development[J]. Biochem J, 1997,321(Pt 1):125-132.

[10] Murashov AK, Chintalgattu V, Islamov RR, et al. RNAi pathway is functional in peripheral nerve axons[J]. Faseb J, 2007,21(3):656-670.

[11] Tsuchiya N, Ochiai M, Nakashima K, et al. SND1, a component of RNA-induced silencing complex, is up-regulated in human colon cancers and implicated in early stage colon carcinogenesis[J]. Cancer Res, 2007,67(19):9568-9576.

[12] Wang N, Du X, Zang L, et al. Prognostic impact of Metadherin-SND1 interaction in colon cancer[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(12):10497-10504.

[13] Yin J, Ding J, Huang L, et al. SND1 affects proliferation of hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 by regulating IGFBP3 expression[J]. Anat Rec (Hoboken), 2013,296(10):1568-1575.

[14] Cappellari M, Bielli P, Paronetto MP, et al. The transcriptional co-activator SND1 is a novel regulator of alternative splicing in prostate cancer cells[J]. Oncogene, 2014,33(29):3794-3802.

[15] Ho J, Kong JW, Choong LY, et al. Novel breast cancer metastasis-associated proteins[J]. J Proteome Res, 2009,8(2):583-594.

Construction of human SND1 lentivirus vector and its application in screening human ovarian cancer cell line SKOV3 for stable expression

RENYuanyuan,LEIJing,ZHAORan,XINLingbiao,SUChao,GAOXingjie,YANGJie

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To construct the lentivirus vector of human SND1 gene and to screen the human ovarian cancer cell line SKOV3 which can stably expresses SND1 protein. Methods The fragment of FLAG-SND1 was cloned from pCMV-FLAG-SND1 plasmid, and then was inserted into lentivirus vector pLVX-IRES-Hyg. The lentivirus expression vector pLVX-FLAG-SND1 was established and was transiently transfected into 293T cells for 48 h. Western blotting was employed to determine SND1 expression. Then the lentivirus expression vector was co-transfected into 293T cells with packaging plasmids to obtain the recombinant lentivirus carrying FLAG-SND1. The lentivirus was collected to infect SKOV3 cells. After 48 h of infection, 1 μg/mL hygromycin B was used to screen the infected cells, so as to obtain a cell line with stable expression of SND1 protein. The expression level of SND1 was detected by Western blotting. Results Double restriction enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated the lentivirus expression vector pLVX-FLAG-SND1 was constructed. The recombinant plasmids were transiently transfected into 293T cells, and the expression level was significantly higher than that of the wild-type SKOV3 cells (P<0.01). In the SKOV3 cells which stably expressed SND1 after infection and drug screening, the expression of SND1 was significantly higher than that of the wild-type SKOV3 cells (P<0.01). Conclusion The SND1 gene lentivirus vector pLVX-FLAG-SND1 is constructed successfully and we screen the SKOV3 cell line stably overexpressing SND1 via lentivirus system.

SND1 gene; lentivirus vector; SKOV3 cells; ovarian carcinoma

國家杰出青年基金資助項目(31125012)；教育部“創新團隊發展計劃”(IRT13085)；國家自然科學基金資助項目(31370749/31571380)；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃青年基金項目(15JCQNJC09900)。

任媛媛(1984-)，女，助理實驗師，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail: happyxinyuren@126.com

楊潔(1968-)，女，教授，研究方向為細胞因子及其信號傳導通路。E-mail: yangj@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.001

Q591.2；Q784

A

1002-266X(2016)28-0001-04

2016-02-26)