絲素蛋白降解菌株的篩選及降解效果研究

[摘 要] 從土壤中分離篩選到2株能降解絲素蛋白的放線菌，對其產酶條件進行研究，結果表明：產絲素蛋白酶的最佳溫度為30℃，培養基最佳起始pH值是8.0，接種培養12 h的種子液，產酶量較高，以2%的接種量接種酶活較高。

[關 鍵 詞] 產絲素蛋白酶；菌株篩選；絲素蛋白降解

[中圖分類號] Q93-33 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-0603（2016）21-0076-02

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質纖維之一。蠶絲中蛋白質含量高達98%以上，主要是由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中，絲素蛋白是蠶絲蛋白的主要組成部分，其水解中間產物為絲肽，具有較好的血壓調節作用、防止腦老化作用、降血糖活性及抑菌活性等功效。當前，絲素蛋白水解可以采用中性鹽解法、酸堿水解法及酶解法等。其中，酶法水解制備絲素肽，因具備成本低、生產條件溫和、高安全性、高選擇性、高穩定性和可控性等優點而受到人們的青睞。

在自然界中，存在著各種各樣可以水解蛋白質的蛋白酶，但由于絲素蛋白是一種典型的β-角蛋白，很難被普通的蛋白酶降解。土壤中存在著豐富的微生物資源，目前認為環境中至少 90%以上的微生物還沒有進行分離培養。我們注意到，蠶繭、絲綢在土壤中很快會腐爛、降解，這說明其中存在著可以降解、利用絲素蛋白的微生物。

本文主要以土壤為來源，通過大量取樣，旨在分離篩選出可降解絲素蛋白的菌株。并從產酶溫度、培養基起始pH、菌株種齡、接種量等方面初步研究該菌株對絲素蛋白降解效果。力爭為絲素纖維的高效降解轉化提供一定的菌種資源和研究依據。

一、材料

（一）土壤來源

浙江省各轄市隨機選取富含枯枝落葉的土壤。

（二）培養基

初篩培養基、鑒別培養基及液體發酵培養基均參照文獻配方制作。

二、方法

（一）降解絲素蛋白的菌株初篩

初篩得到的菌株用滅菌牙簽點接到鑒別培養基上，28℃培養48h，選擇菌落周圍產透明圈的菌株，進行液體發酵并測定酶活。

（二）降解絲素蛋白的菌株復篩

將產透明圈的菌株接種于液體發酵培養基，28℃下160r/min搖床振蕩培養，每隔24h取樣，3500r/min，離心10min，收集上清液測定酶活，篩選出纖維素酶高產放線菌菌株，并進行酶活的測定。

（三）菌株產酶條件研究

研究不同溫度、培養基初始pH值、菌株種齡和接種量對產絲素蛋白酶的影響。

（四）菌株絲素蛋白降解效果的影響

降解率的測定：將篩選菌株進行發酵培養，培養時以2%的接種量接種于以絲素蛋白為唯一碳源的液體發酵培養基中，30℃下160r/min搖床振蕩培養96h，把所得發酵液過濾并水洗以除去菌體，干燥后稱重并計算降解率：

降解率=（降解前質量-降解后殘渣質量）/降解前質量×100%。

三、結果與討論

（一）絲素蛋白降解菌株的分離純化與篩選

經過初篩，分離純化出18個菌株，從中篩選出具有酶活性的菌株12株。最后將這12個菌株進行液體發酵測定酶活，最終從樣品中分離篩選出2株能較好地降解絲素蛋白的菌株，并初步判斷2株均為放線菌。2株菌的酶活定量測定結果見表1。

從表1可以發現，當培養時間為96h時，N6菌株可以達到90.55U的酶活力，高于N1菌株。所以，可以初步判定，在相同培養時間內，N6菌株酶活力較好。

（二）不同培養溫度對菌株產酶的影響

將菌株N1和N6，同時接種于液體發酵培養基中，在不同培養溫度（20℃，25℃，30℃，35℃，40℃）條件下，160r/min，培養96h后，取樣測酶活，結果見表2。

從表2可知，在溫度為20℃～30℃之間，兩株菌株產酶酶活隨著溫度升高而逐漸增強，30℃～40℃之間，產酶酶活隨著溫度升高而逐漸減弱，并且，在發酵溫度為30℃時，產酶酶活均達到最高值。由此可知，兩株菌株產酶最佳溫度均為30℃，當生長溫度低于或高于30℃時，菌體生長均會受到限制，生長量將大大減少，因此，產酶會減少，酶活亦大大降低。

此外，還可以發現，無論在哪個溫度條件下培養，N6菌株產酶的酶活均要高于N1菌株。為此，我們可以選擇30℃作為菌株培養的最佳溫度，而選擇N6菌株可以得到較高的酶活。

（三）不同培養基初始pH對菌株產酶的影響

將菌株N1和N6同時接種于液體發酵培養基中，在不同初始pH（pH6.0，pH7.0，pH8.0，pH9.0，pH10.0）條件下，160r/min，培養96h后，取樣測酶活，結果見表3。

從表3可知，培養基初始pH為8時，菌株產酶酶活力最高，并且可以發現，當pH為7～9范圍內時，絲素蛋白酶酶活力變化不明顯，但當pH低于7或高于9時，酶活出現明顯下降趨勢。此外，亦可以發現，無論在哪個pH條件下培養，N6菌株產酶的酶活均要明顯高于N1菌株。為此，我們可以選擇初始pH8作為菌株培養最佳初始pH，而選擇N6菌株可以得到較高的酶活。

（四）不同種齡對菌株產酶的影響

選擇不同種齡的菌株N1和N6（12h，24h，36h，48h，60h），同時接種于液體發酵培養基中，160r/min，培養96h后，取樣測酶活，結果見表4。

由表4可知，隨著種齡的增加，N1菌株和N6菌株產酶酶活反而逐漸下降。當種齡為12h時，兩株菌株的酶活均達到最大值，尤其是N6菌株酶活顯著高于N3，已達到90U。根據以上結果，可選擇培養12h的N6菌株，可達到較好的實驗結果，獲得較高酶活的產絲素蛋白酶。

（五）不同接種量對菌株產酶的影響

選擇不同接種量（1%，2%，3%，4%，5%），將菌株N1和N6，同時接種于液體發酵培養基中，160r/min，培養96h后，取樣測酶活，結果見表5。

由表5可知，當接種量為2%時，N1菌株和N6菌株產酶酶活均達到最高值。當接種量大于2%時，隨著接種量增加，酶活反而出現下降趨勢，為此，可以選擇2%作為最佳接種量。此外，無論何種接種量，N6菌株的酶活均顯著高于N1菌株。

（六）不同菌株對絲素蛋白的降解效果

將篩選出的2株放線菌菌株N1和N6分別接種于以絲素為唯一碳源的液體發酵培養基中，相同條件下培養7d，N1菌株的降解率為68%，N6菌株的降解率為82%，差異不是特別明顯，但N6菌株產酶降解率略微高于N1菌株，這與以上研究產酶條件時得出的結果基本相符。

本研究分離篩選出2株產絲素蛋白酶能力較強的放線菌菌株，并對其產酶條件進行研究。研究結果表明，產絲素蛋白酶的最佳溫度為30℃，培養基最佳起始pH值是8.0，接種培養12h的種子液，產酶量較高，以2%的接種量接種酶活較高。本實驗只是進行初步研究，要獲得更詳細的實驗數據，還需開展后續更深入的探究。

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