人參皂苷Rg1對MC3T3-E1成骨細胞增殖分化的相關(guān)研究①

段　峰,栗　秋,趙　剛

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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人參皂苷Rg1對MC3T3-E1成骨細胞增殖分化的相關(guān)研究①

段峰1,栗秋2,趙剛1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的:研究人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,簡稱Rg1)對MC3T3-E1小鼠成骨細胞增值、分化及遷移能力的影響。方法:采用不同濃度人參皂苷Rg1,1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL對MC3T3-E1進行CCK-8細胞增值的影響，采用ALP進行細胞分化的檢測。結(jié)果:與標準組對比Rg1濃度在1×10-3mg/mL時可明顯促進細胞增殖,分化(P<0.05)。結(jié)論:人參皂苷Rg1可促進MC3T3-E1成骨細胞增殖分化。

關(guān)鍵詞:人參皂苷Rg1；小鼠成骨細胞MC3T3-E1;細胞增殖；分化

面對頜面部損傷患者數(shù)量的不斷增加，頜面部骨缺損逐漸被人們所關(guān)注。同時人們對于牙齒美觀的要求也逐步加強，正畸學(xué)的研究方向也從矯治力學(xué)向牙齒移動生物學(xué)方向延伸。頜面部骨組織的新生與吸收以及牙槽骨的新生與吸收一直是醫(yī)生所關(guān)注的方向與重點。中國傳統(tǒng)中藥促骨骼愈合，多年來在臨床與科研方面一直被人們所追尋。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，簡稱Rg1)主要來源于，五加科人參屬人參的根中，是其主要有效成分[1]。人參主補五臟，能增強機體免疫力，抗休克、增強骨質(zhì)也有一定的治療作用[2,3]。人參皂苷Rg1，其結(jié)構(gòu)主要為四環(huán)三萜類衍生物，晶性粉末(正丁醇-甲基乙基酮或甲酸乙酯)。已有實驗證實腹腔注射100mg/kg, 4h后Rg1使骨髓細胞的DNA的生物合成明顯增加。本實驗從細胞角度，研究Rg1對成骨細胞增值，分化，遷移的影響，不僅為臨床實踐，體外實驗提供理論依據(jù)，同時也是生物藥學(xué)追尋的熱點。

1材料方法

1.1主要試劑

人參皂苷Rg1標準品(上海金穗生物科技有限公司HPLC≥98%)、成骨細胞MC3T3-E1(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心)、胎牛血清(Gibco公司)、青霉素鏈霉素溶液-雙抗(HyClone海可隆公司)、0.25%胰蛋白酶消化液(HyClone海可隆公司)、PBS(碧云天生物技術(shù)研究所)、95%無水乙醇(天津市巴斯夫化工有限公司)、Cell Counting Kit-8(BOSTER博士德生物) 、ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2主要儀器

電子天平(Ohaus,美國)、Olympus顯微鏡(日本Olympus顯微鏡)、酶標儀(Takara,日本)、,S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)。

1.3方法

1.3.1細胞的準備

小鼠前成骨細胞株 MC3T3 E1源于上海中科院細胞庫。MC3T3 E1細胞置于基本培養(yǎng)液中，在37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2~3d換液1次，待細胞融合至80%~90%時，用0. 25%胰蛋白酶消化，懸成 1×10-5/mL的密度備用。

1.3.2人參皂苷Rg1濃度配制

將購買純度大于98%的人參皂苷Rg1 10mg分別溶解于10mL溶液中，溶液含總體積2%的無水乙醇，總體積98%的培養(yǎng)液，配成終濃度為1mg/mL的人參皂苷Rg1，用10倍稀釋法，逐梯度配制出1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的人參皂苷Rg1溶液，置于離心管中外用錫紙遮住避光備用。

1.3.3細胞增殖能力檢測CCK-8

取1塊96孔板，將其分為8組，即1個對照組、7個實驗組，每組5個復(fù)孔，用0.25%的胰酶消化懸浮成骨細胞，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，各組均加入100μL的細胞懸液。置37℃、飽和濕度5%CO2細胞孵育箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，細胞貼壁。對照組不加任何試劑；7個實驗組各加入濃度分別為1mg/mL、1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的人參皂苷Rg1 100μL，置37℃溫箱。細胞培養(yǎng)，并分別于24h，48h，72h取出96孔板，去除上懸液，并用PBS清洗，后加入20μL CCK-8檢測試劑，避光入37℃、飽和濕度，5%CO2細胞孵育箱中培養(yǎng)4 h取出用酶標儀測吸光度值激發(fā)光波長為450nm。

1.3.4細胞分化能力檢測ALP

取96孔板，將其分為6組，即1個對照組，5個實驗組，調(diào)整細胞濃度為1 × 105孔/mL，每組5個復(fù)孔加入100μL的細胞懸液。置37℃、飽和濕度、5%CO2細胞孵育箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，細胞貼壁。對照組不加任何試劑；實驗組各加入濃度分別為1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的Rg1 100μL，置37℃溫箱。分別于3d，7d，14d取出按堿性磷酸酶ALP測試盒說明書進行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS軟件17.0版本進行方差分析。用所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差表示，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 CCK-8檢測細胞增殖結(jié)果

人參皂苷Rg1在24h、48h、72h時1×10-1~1×10-5mg/mL濃度范圍內(nèi)可明顯促進細胞增殖，且1×10-3mg/mL時細胞增殖最為明顯。但在24h時，Rg1濃度為1mg/mL與1×10-6mg/mL時所測數(shù)值與標準組相對比時無意義(P>0.05)。見表1。

組別24h48h72h標準組0.108±0.0220.149±0.0330.203±0.0211mg/mL0.109±0.1121×10-1mg/mL0.142±0.0100.250±0.0850.298±0.0331×10-2mg/mL0.154±0.0470.300±0.0920.501±0.0151×10-3mg/mL0.218V0.0480.476±0.1210.807±0.0181×10-4mg/mL0.148±0.0150.292±0.0810.606±0.0151×10-5mg/mL0.140±0.0080.30±0.0680.527±0.0551×10-6mg/mL0.140±0.118

注:1)24h時1mg/mL與1×10-6mg/mL數(shù)值無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2)其他濃度數(shù)值與標準組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2ALP檢測細胞分化結(jié)果

人參皂苷Rg1的不同濃度1×10-1~1×10-5mg/mL在3d，7d，14d與標準組相對比，隨時間的增長ALP活性相對增加，且在1×10-3mg/mL時活性最為明顯(P<0.05)。見表2。

表2　ALP檢測不同濃度Rg1對MC3T3-E1分化

注：與標準組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

面對日益增多的正畸病例以及頜面外科骨損傷患者，牙槽骨吸收、形成和穩(wěn)定，頜面部骨組織破損的修復(fù)與形成，無疑與骨組織的形成緊密相關(guān)，因而頜面部促進骨組織形成已成為當(dāng)前解決口腔頜面部骨損傷的首要問題。骨的形成要經(jīng)歷成骨細胞增殖，細胞外基質(zhì)成熟，細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡四個階段，起始階段成骨細胞的增殖無疑奠定了骨形成的重要基礎(chǔ)，成骨細胞因此可稱為骨形成中必不可少的結(jié)構(gòu)[4]。成骨細胞增殖期細胞數(shù)量增加，以形成多層細胞，并合成分泌Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結(jié)節(jié)，進而修復(fù)骨缺損，因此成骨細胞對骨組織的生長發(fā)育，損傷修復(fù)，骨代謝平衡與骨量維持起著關(guān)鍵作用[5,6]。

我國傳統(tǒng)中藥人參是著名的強壯滋補藥，人參皂苷Rg1是人參中主要的活性成分，可促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，骨髓基質(zhì)細胞等多種細胞的增殖和分化。人參皂苷可促進骨形成，能有效預(yù)防去卵巢大鼠的骨量丟失。因此，本實驗選用不同濃度的人參皂苷Rg1與成骨細胞進行培養(yǎng)，并觀察成骨細胞增殖、分化情況[7]。

Cell Counting Kit-8細胞增值及細胞毒性檢測盒(簡稱CCK-8)是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細胞增值和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。本實驗CCK-8于24h Rg1濃度1mg/mL與1×10-6mg/mL數(shù)值與標準組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此本實驗最終濃度確定為1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL，由數(shù)據(jù)顯示，與標準組相比實驗組濃度隨時間梯度，成骨細胞增殖能力不斷增加，1×10-3mg/mL時細胞增殖最為明顯，人參皂苷Rg1可促進成骨細胞增殖。

堿性磷酸酶在骨和牙齒等礦化組織形成中起著重要作用。ALP活性增高被認為是組織發(fā)生礦化的前提條件，通過測定ALP活性，可以反映骨分化的能力，本實驗數(shù)據(jù)顯示，14d時細胞分化程度最好，且濃度于1×10-3mg/mL時ALP活性明顯高于其他實驗組，人參皂苷Rg1可促進成骨細胞ALP活性。

本實驗通過以上結(jié)果與討論，證實人參皂苷Rg1可促進成骨細胞MC3T3-E1的增殖、分化。對頜面部成骨細胞形成有促進作用，此實驗可為臨床實踐，體外實驗提供理論依據(jù)。

參考文獻:

[1]Gong L, Li S L,Li H,et al.Ginsenoside Rg1 protects primary cultured rat hippocampal neurons from cell apoptosis induced by β-amyloid protein[J].Pharm Biol,2011,49(5):501-507

[2]Fang F,Chen X,Huang T,et al.Multi-faced neuroprotective effects of Ginsenoside Rg1 in an Alzheimer mouse model[J].Biochim Biophys Acta,2012,1822(2):286-292

[3]Shi A W,Gu N,Liu X M,et al.Ginsenoside Rg1 enhances endothelial progenitor cell angiogenic potency and prevents senescence in vitro[J].J Int Med Res,2011,39(4):1306-1318

[4]莊朋偉，張艷軍，龐坦.人參皂苷Rg1 促進體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增值的研究[J].中國中藥雜志，2009,34(4)：443-446

[5]陳述祥，康樂.中藥促成骨細胞增值和分化的基質(zhì)與作用[J].中國組織工程研究，2012,16(7)：1299-1302

[6]ThomasM Bodenstine，Benjanmin H Beck,Leah M Cook，et al.Pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells promote breast cancer growth in bone in a murine xenograft modle[J].Chinese Journal of Cancer,2011,03(7):123-125

[7]王萍，周玥，王亞平.人參皂苷Rg1促進人牙周膜干細胞增殖與成骨分化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013,15:1566-1569

(收稿日期：2015-06-09)

中圖分類號：R782.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0094-02

作者簡介:段峰(1972~)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。通訊作者:栗秋(1989~)女,黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。E-mail：970601377@qq.com。