慢性乙型肝炎患者核苷酸類藥物治療過程HBsAg定量和HBV-DNA相關性研究

葉　揚，郭　煒，呂蕙伶　(新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州人民醫(yī)院檢驗科,新疆 昌吉 831100 )

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慢性乙型肝炎患者核苷酸類藥物治療過程HBsAg定量和HBV-DNA相關性研究

葉揚，郭煒，呂蕙伶(新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州人民醫(yī)院檢驗科,新疆 昌吉 831100 )

【摘要】目的：探討ELISA法檢測HBsAg定量及實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測HBV-DNA在乙型肝炎病毒(HBV)感染核苷酸類藥物診療中的應用價值，了解用ELISA法檢測HBV-M不同的標志物組合時，其對應的HBV-DNA陰、陽性及陽性的拷貝數(shù). 方法：用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法定量檢測800例患者的血清HBV-DNA含量(臨界值為500 copies/mL),同時用ELISA法測定HBV血清標記物. 結(jié)果：經(jīng)FQ-PCR檢測,347份HBsAg,HBeAg,抗-HBcAb,ProS1-Ag都陽性的標本,HBV-DNA陽性率為98.7%,平均拷貝數(shù)為1.87×108 copy/mL,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05). HBAg,HBeAg,ProS1-Ag一項或多項陽性者的HBV-DNA陽性率和平均拷貝數(shù)顯高于三項抗原全陰者. 結(jié)論：HBsAg是肝細胞受到HBV感染的標志，HBsAg清除是肝內(nèi)HBV感染的免疫控制和抗病毒應答的標志；FQ-PCR可以快速而準確地檢測HBV-DNA拷貝數(shù). HBV-DNA可準確、靈敏地反映HBV復制. 與HBV血清標記物聯(lián)合應用可使診斷更準確,治療更合理. 對疾病的診斷，治療過程的監(jiān)測，愈后監(jiān)控及藥效評價等都具有很高的實用價值.

【關鍵詞】實時熒光定量;乙型肝炎病毒;核苷酸類藥物

0引言

HBV血清標志物HBsAg是肝細胞受到HBV感染的標志,HBsAg清除是肝內(nèi)HBV感染的免疫控制和抗病毒應答的標志，HBsAg清除最接近治愈，相比HBV DNA， HBsAg清除能更好地代表疾病的持久緩解，HBsAg清除可改善臨床預后：降低肝硬化和肝癌的發(fā)生率；提高生存率. 最近的研究報告[1]顯示：肝細胞內(nèi) cccDNA 水平(HBV感染細胞的標志)和血清HBsAg 水平存在顯著相關性.

實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法因采用了Taqman熒光探針定量技術(shù)和完全封閉的檢測方法,與傳統(tǒng)聚合酶鏈反應方法相比有三大優(yōu)勢:即可以精確定量、減少假陽性、減少對操作人員和環(huán)境的污染,因而應用日益廣泛[2]. 我們應用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測患者血清HBV-DNA,并與其HBV血清標記物比較. 臨床常用ELISA法進行HBV-M的檢測和PCR法進行HBV-DNA的定性檢測來判斷HBV的感染或療效.

1資料和方法

1.1一般資料選取昌吉回族自治州人民醫(yī)院2013-05/2015-08收治的800例乙型肝炎病毒感染者和無癥狀查體者作為研究對象. 其中女289例,男511例. 年齡9～78(平均38)歲. 清晨空腹靜脈取血2 mL送檢.

1.2試劑與方法

1.2.1HBV免疫血清標志物用ELISA法檢測試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供，采用酶標儀進行結(jié)果判斷，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書操作.

1.2.2測定方法血清HBV-DNA測定采用FQ-PCR,試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供，擴增儀為瑞士 Roche Light Cycler核酸擴增儀，檢測方法嚴格按照試劑盒及儀器的說明書操作.

2結(jié)果

ELISA法檢測HBV-M時，以HBsAg為1，抗-HBs為2，HBeAg為3，抗-HBe為4，-HBc為5. 10組 HBV-ELISA法檢測HBDNA的檢測結(jié)果比較見表.

表110組HBV-DNA定量結(jié)果與HBV-M檢測結(jié)果比較

組別例數(shù)HBV-M陽性HBV-DNA陽性(%)HBV-DNA陽性定量結(jié)果對數(shù)值第1組3471,3,5345(99)7.91±1.13第2組2101,4,5187(89)4.73±0.94第3組521,518(34.6)4.01第4組57117(29.8)3.61第5組312,54(12.9)3.16第6組291,327(93.1)6.94第7組271,48(29.6)3.87第8組3356(18.2)3.22第9組1020(0)0第10組43,54(100)8.17合計800616(77)

3討論

用ELISA法作HBV-M是臨床應用最廣泛的診斷HBV感染，評價HBV傳染性及愈后的手段. 本研究中，第1組(俗稱大三陽)，其FQ-PCR法的HBV-DNA陽性率達99%，定量結(jié)果對數(shù)值高達7.91，表明HBV-DNA復制活躍，HBV濃度高，傳染性很強. 第2組(俗稱小三陽)，其FQ-PCR法的HBV-DNA陽性率為89%，定量結(jié)果對數(shù)值為4.73，相對于第1組而言，其HBV-DNA復制欠活躍，HBV濃度稍低一些，傳染性也稍差一些. 兩者的結(jié)果是相互關聯(lián)的，兩者具有相似的流行病學意義，同時也反映了HBV-DNA PCR定量檢測結(jié)果陽性率更高，更能直接體現(xiàn)HBV的復制過程[2].

FQ-PCR法檢測HBV-DNA的陽性率與HBV-M的HBeAg的陽性有很好的伴隨關系. 從第1組和第6組可以看出：當HBeAg(+)時，HBV-DNA的陽性率分別為99%和93.1%，且定量結(jié)果對數(shù)值為7.91和6.94[3]. 第10組的定量結(jié)果對數(shù)值更高達8.17. 這3組的定量結(jié)果對數(shù)值與其余各組的值，分別作采用成組設計的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗統(tǒng)計學處理，發(fā)現(xiàn)有顯著性差異. 當HBeAg(+)時，HBV-DNA卻為(-)，可能的原因是：藥物使HBV-DNA復制受抑制或試驗中樣本HBV-DNA丟失或與引物對應的DNA序列變異.

在所有HBsAg(+)665例中，F(xiàn)Q-PCR法HBV-DNA陽性602例，陽性率90.5%. 陰性的63例中有17例是在半年到2年前乙肝大三陽(當時未作HBV-DNA定量)，接受賀普丁或干擾素治療后再測HBV-DNA定量的. 63例陰性的可能原因是HBV-DNA整合到宿主細胞內(nèi)或PCR引物與HBV-DNA不匹配或HBV-DNA基因發(fā)生變異或生物療法抑制或掩蓋了HBV-DNA的復制[4].

第10組是HBeAg(+)，抗-HBc(+)，但HBV-DNA定量結(jié)果很高，其定量結(jié)果對數(shù)值高達8.17. 但對該標本稀釋20倍后再用ELISA法測HBV-M，結(jié)果是HBsAg(+)，證實是HOOK現(xiàn)象[5].

乙型肝炎病毒(HBV)感染人體是一個連續(xù)動態(tài)的過程，用ELISA法檢測免疫標志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)可在一定程度上反映病毒是否處于復制狀態(tài)，而PCR法檢測HBV-DNA含量水平能直接體現(xiàn)HBV復制過程. 敏感性更強，特異性更高. 本研究探討血清HBV-DNA與免疫標志物HBsAg等定量的相關性、符合性和補充性，在 HBsAg 和 HBV-DNA 水平有非常好的相關性，HBV DNA 是評估 HBV復制的金標準,從而進一步證實血清HBsAg和HBV-DNA檢測在乙型肝炎早期診斷、傳染性識別、病毒復制水平判斷以及抗病毒藥物的選擇、治療效果以及監(jiān)測的臨床價值.

【參考文獻】

[1] Colombatto P, Civitano L, Bizzarri R, et al. A multiphase model of the dynamics of HBV infection in HBeAg-negative patients during pegylated interferon-alpha2a, lamivudine and combination therapy[J]. Antivir Ther, 2006, 11(2):197-212.

[2] 呂卉，馬立憲，徐皖蘇，等. 定量檢測慢性乙型肝炎患者肝組織乙型肝炎病毒DNA的臨床價值[J]. 中華肝臟病雜志,2003,11(3):173-175.

[3] 戴晨陽,戴晨琳. 定量聚合酶鏈反應檢測乙型肝炎患者血清HBV-DNA及其臨床應用[J]. 天津醫(yī)藥,1999,27(9):515-517.

[4] 程鋼,何蘊韶,周新宇.熒光定量聚合酶鏈反應檢測乙型肝炎病毒[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志,1999,22(3):135-138.

[5] Ghany M, Liang TJ. Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B [J]. Gastroenterology, 2007,132(4):1574-1585.

Correlation of HBsAg quantitation and HBV-DNA in patients with chronic hepatitis B treated by nucleotide drug

YEYang,GUOWei,LVHui-Ling

Clinical Laboratory, People’s Hospital Changji Hui Autonomous Prefecture, Changji 831100,China

【Abstract】AIM: To investigate the value of HBV-DNA copies detected by real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR) and serological markers of HBV detected by ELISA method in the diagnosis and therapy of HBV infection. METHODS: HBV-DNA contents of 800 patients’ serum were detected by real-time FQ-PCR. The cutoff is 500 copies/mL. Their serological markers of HBV were detected by ELISA method. Both results of HBV-DNA and serological markers of HBV were compared. RESULTS: In the 347 samples with HBsAg(+),HBeAg(+), HBcAb(+) and ProS1-Ag(+) samples, HBV-DNA positive ratio and mean of copies were respectively 98.7% and 1.87×108 copies/mL. They were much higher than that of other groups (P<0.05). The HBsAg(-), HBeAg(-), ProS1-Ag(-) group’s positive ratio and copy number of HBV-DNA were much lower than that of HBsAg(+) and/or HBeAg(+), and/or ProS1-Ag(+) group, with statistically significant difference between the two groups(P<0.05). CONCLUSION: HBsAg is a sign of liver cells with HBV infection. HBsAg clearance is immune control of HBV infection in the liver and the mark of antiviral response. FQ-PCR is a fast and accurate technique to quantify the serum HBV-DNA. HBV-DNA can reflect HBV replication accurately. Combinating the HBV-DNA and the serological markers of HBV would make the diagnosis and therapy of HBV infection more reasonable and efficient.

【Keywords】real-time fluorescent quantitative;hepatitis B virus; nucleotide drugs

【中圖分類號】R512.62

【文獻標識碼】A

作者簡介：葉揚. 碩士. 研究方向：臨床醫(yī)學檢驗診斷及現(xiàn)代分子生物工程技術(shù). Tel:0994-2218115E-mail:yeyang0728@foxmail.com

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生計生委青年科技人才專項科研項目(2015Y06)

收稿日期：2015-11-25；接受日期：2015-12-10

文章編號：2095-6894(2016)01-53-02

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