黃芪甲苷聯用維生素D3對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

王婷梅，梅其炳，曲麗娜，李瑩輝，

(1.西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072；

2.中國航天員科研訓練中心航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京100094)

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黃芪甲苷聯用維生素D3對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

王婷梅1，梅其炳1，曲麗娜2，李瑩輝1，2

(1.西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072；

2.中國航天員科研訓練中心航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京100094)

摘要：探討了黃芪提取物黃芪甲苷與維生素D3聯用對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響。離體培養大鼠原代成骨細胞后，用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等方法對細胞進行鑒定；通過細胞回轉器模擬微重力效應，采用MTT、細胞計數等方法研究不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液對大鼠原代成骨細胞增殖的影響。結果表明，單用黃芪甲苷或維生素D3均對正常培養成骨細胞增殖具有促進作用，最佳促增殖濃度分別為1×10-7mol·L-1和1×10-8mol·L-1，當1×10-7mol·L-1黃芪甲苷分別配以1×10-9mol·L-1或1×10-8mol·L-1維生素D3時，其相對增殖率可達200%和196%；不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液對模擬微重力下二維回轉培養成骨細胞的增殖有顯著促進作用，其最佳促增殖濃度為1×10-7mol·L-1黃芪甲苷配以1×10-9mol·L-1維生素D3。

關鍵詞：黃芪甲苷；維生素D3；成骨細胞；二維回轉培養；模擬微重力；細胞增殖

航天飛行實踐或地面模擬實驗證實，當機體處于微重力環境時，人體骨骼系統會出現骨密度降低、骨量丟失、骨力學性能下降、骨骼脫礦等一系列類似臨床骨質疏松(osteoporosis)癥狀，即出現失重性骨丟失[1-4]。為了防止失重性骨丟失對航天員造成不良影響，人們開展了一系列關于失重性骨丟失防護措施的研究。

中醫藥在我國有著數千年的歷史，是中華民族的寶貴財富。將中國傳統醫學與航天醫學結合，是我國航天醫學發展的獨特優勢。骨質疏松歸屬于中醫骨痿、骨枯、骨痹范疇，中醫臨床采用補腎壯骨、健脾益氣、活血養肝等措施防治骨質疏松，長期的臨床實踐發現了許多療效確切、副作用小且能長期服用的中藥，如淫羊藿、地黃、黃芪、骨碎補、補骨脂、續斷、杜仲等。失重性骨丟失主要發生在承重骨，其主要原因是骨形成的減少[5-11]。成骨細胞作為骨形成的功能細胞，成為失重性骨丟失發生機制及藥物防護相關研究的主要研究對象，可通過刺激成骨細胞的骨形成作用來防止失重性骨丟失。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus rnembranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus embranaceus (Fisch.)Bge.的干燥根[12]，具有補氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌等功效。研究發現，黃芪的主要有效成分為皂苷、黃酮、多糖及氨基酸類化合物，具有多種藥理作用[13]。中藥臨床研究發現，黃芪或含有黃芪的方劑可以有效阻止絕經后骨質疏松患者骨量丟失[14-15]。

維生素D3又名煙堿酸胺、膽骨化醇，是維生素D家族中最重要的成員之一。其本身是一種激素原，無活性。維生素D3經肝臟代謝為25-羥膽鈣化醇，再由腎臟進一步羥化為其活性形式1，25(OH)2D3，然后1，25(OH)2D3與其特異性受體VDR結合來發揮其生物學效應。有資料顯示，失重導致負鈣平衡的同時伴隨血清1，25(OH)2D3水平降低。因此，作者針對失重性骨丟失這一熱點問題，利用二維回轉模擬微重力效應，采用MTT、細胞計數等方法研究不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液對大鼠原代成骨細胞增殖分化的影響，以期為航天微重力環境下失重性骨丟失的藥物防護提供依據。

1實驗

1.1試劑與儀器

DMEM高糖細胞培養液、胎牛血清、0.25% 胰酶、L-谷氨酰胺，美國Hyclone公司；膠原酶、胰蛋白酶、MTT、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸，美國Sigma公司；ALP染色試劑盒，南京建成生物工程研究所；茜素紅，天津化學試劑廠。

細胞培養箱、低溫臺式高速離心機，德國Heraus公司；超純水系統，美國Millipore公司；熒光顯微鏡，日本Nikon公司；數碼照相機，日本Olympus公司；雙向多樣本回轉器，中國航天員科研訓練中心；多功能酶標儀，美國BIO-TEK公司。

1.2大鼠原代成骨細胞的分離培養及鑒定

取出生1～2d的SD乳鼠，采用多次酶消化法進行SD乳鼠顱骨原代成骨細胞的分離與培養；在鏡下觀察原代成骨細胞的形態，并采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等方法對其進行鑒定，取3～6代成骨細胞用于實驗。

1.3黃芪甲苷與維生素D3聯用對正常培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

將大鼠原代成骨細胞培養至4代時消化，調整細胞密度為2.5×103個·孔-1，接種于96孔板，每孔接種體積為100μL，孵育8h后，分別加入不同濃度的黃芪甲苷、維生素D3及不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液進行藥物處理，每組設8個副孔。藥物處理48h后，每孔加入已配好的MTT溶液20μL，置于CO2培養箱中繼續孵育4h，終止培養，小心移除培養液，然后每孔加入DMSO溶液150μL，避光振蕩10min，在酶標儀上讀取570nm處的吸光度。以空白對照為基準計算細胞相對增殖率，確定黃芪甲苷、維生素D3的最佳濃度及黃芪甲苷與維生素D3混合液的最佳濃度配比。

1.4黃芪甲苷與維生素D3聯用對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

將對數生長期的大鼠原代成骨細胞以1.2×105個·片-1的細胞數接種于滅菌處理的血蓋片上，細胞貼附后，加入最佳濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液進行藥物處理。二維回轉培養48 h后取出細胞培養片，采用細胞計數法研究黃芪甲苷與維生素D3混合液對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響。

采用SPSS 11.0軟件對實驗數據進行統計學分析。數據以均數+標準差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間的比較用LSD檢驗。P<0.05為顯著性差異。

2結果與討論

2.1大鼠原代成骨細胞的鑒定

鏡下觀察分離培養的大鼠原代成骨細胞的形態及堿性磷酸酶染色、茜素紅染色結果，如圖1所示。

培養48 h　　　　　　　　　　培養7 d　　　　　　　　　堿性磷酸酶染色　　　　　　　　茜素紅染色

實驗發現，培養24 h左右，有少量細胞貼壁生長，貼壁生長細胞為梭形或多邊形；培養48 h后，細胞基本貼壁生長(圖1a)；培養7 d左右，能夠長滿培養瓶壁(圖1b)。

堿性磷酸酶是成骨細胞分化的特異性標志，而大鼠原代成骨細胞堿性磷酸酶染色結果呈陽性，大部分細胞染色呈深藍色(圖1c)。

成骨細胞在體外培養時，長滿后如不進行傳代繼續培養，則細胞可以重疊生長，并分泌大量基質形成結節，隨著培養時間的延長，便發生礦化，一般培養2～3周左右即會出現礦化結節。實驗發現，大鼠原代成骨細胞培養至14 d左右時便有結節形成，繼續培養至21 d后進行茜素紅染色，發現有一些大小形態各異的紅色至暗紅色斑塊(圖1d)。

上述實驗結果均與成骨細胞生物學特性相符，表明分離培養的細胞確為成骨細胞。

2.2黃芪甲苷與維生素D3聯用對正常培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

2.2.1黃芪甲苷的影響

大鼠原代成骨細胞經不同濃度的黃芪甲苷處理后，采用MTT法測定細胞相對增殖率，結果見圖2。

由圖2可知，與對照組相比，用濃度分別為1×10-10mol·L-1、1×10-9mol·L-1、1×10-8mol·L-1、1×10-7mol·L-1、1×10-6mol·L-1的黃芪甲苷處理48 h后均能促進大鼠原代成骨細胞的增殖(P<0.05 &P<0.01)。其中，黃芪甲苷濃度為1×10-7mol·L-1的促增殖效果最顯著(P<0.01)。

2.2.2維生素D3的影響

大鼠原代成骨細胞經不同濃度的維生素D3處理后，采用MTT法測定細胞相對增殖率，結果見圖3。

*：P<0.05(vs.對照)　**：P<0.01(vs.對照)

*：P<0.05(vs.對照)　**：P<0.01(vs.對照)

由圖3可知，與對照組相比，用濃度分別為1×10-10mol·L-1、1×10-9mol·L-1、1×10-8mol·L-1、1×10-7mol·L-1的維生素D3處理48 h后均能促進大鼠原代成骨細胞的增殖(P<0.05 &P<0.01)。其中，維生素D3濃度為1×10-8mol·L-1的促增殖效果最顯著(P<0.01)。

2.2.3黃芪甲苷與維生素D3混合液的影響

將大鼠原代成骨細胞用不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液處理48 h，采用MTT法測定細胞相對增殖率，結果見圖4。

1～6，黃芪甲苷濃度(mol·L-1)：0，1×10-10，

由圖4可知，當不同濃度黃芪甲苷與不同濃度維生素D3聯用時，其促進細胞增殖作用優于單獨使用黃芪甲苷。其中，當黃芪甲苷濃度為1×10-7mol·L-1、維生素D3濃度為1×10-9mol·L-1或1×10-8mol·L-1時，促增殖效果最佳(P<0.01)，其相對增殖率分別達到200%和196%。

2.3黃芪甲苷與維生素D3聯用對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響

選取具有最佳促增殖效果的藥物組合處理二維回轉培養大鼠原代成骨細胞48 h，即用1×10-7mol·L-1黃芪甲苷與1×10-9mol·L-1維生素D3混合液以及1×10-7mol·L-1黃芪甲苷與1×10-8mol·L-1維生素D3混合液分別處理回轉培養細胞，然后采用細胞計數法測定細胞增殖情況，結果見圖5。

由圖5可知，1×10-7mol·L-1黃芪甲苷及1×10-7mol·L-1黃芪甲苷分別配以1×10-9mol·L-1、1×10-8mol·L-1維生素D3的混合液處理組的細胞數顯著高于對照組細胞數(P<0.05 &P<0.01)；1×10-7mol·L-1黃芪甲苷與1×10-9mol·L-1維生素D3混合液對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞的促增殖效果明顯優于單獨使用黃芪甲苷組(P<0.05)。

*：P<0.05(vs.對照)**：P<0.01(vs.對照)

圖5二維回轉培養條件下，黃芪甲苷與維生素D3

聯用對大鼠原代成骨細胞增殖的影響

Fig.5Effect of astragaloside Ⅳ combined with vitamin D3

on the proliferation of rat primary osteoblasts

during 2D-clinorotation culture

3結論

探討了黃芪提取物黃芪甲苷與維生素D3聯用對二維回轉培養大鼠原代成骨細胞增殖的影響。離體培養大鼠原代成骨細胞后，用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等方法對細胞進行鑒定；通過細胞回轉器模擬微重力效應，采用MTT、細胞計數等方法研究不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液對大鼠原代成骨細胞增殖的影響。結果表明，單用黃芪甲苷或維生素D3均對正常培養成骨細胞增殖具有促進作用，最佳促增殖濃度分別為1×10-7mol·L-1和1×10-8mol·L-1，當1×10-7mol·L-1黃芪甲苷分別配以1×10-9mol·L-1或1×10-8mol·L-1維生素D3時，其相對增殖率可達200%和196%；不同濃度配比的黃芪甲苷與維生素D3混合液對模擬微重力下二維回轉培養成骨細胞的增殖有顯著促進作用，其最佳促增殖濃度為1×10-7mol·L-1黃芪甲苷配以1×10-9mol·L-1維生素D3。

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Effect of Astragaloside Ⅳ Combined with Vitamin D3on Proliferation of Rat Primary Osteoblasts During 2D-Clinorotation Culture

WANG Ting-mei1，MEI Qi-bing1，QU Li-na2，LI Ying-hui1，2

(1.SchoolofLifeScience，NorthwesternPolytechnicalUniversity，Xi′an710072，China;2.StateKeyLabofSpaceMedicineFundamentalsandApplication，ChinaAstronautResearchandTrainingCenter，Beijing100094，China)

Abstract：Effect of astragaloside Ⅳ combined with vitamin D3 on the proliferation of rat primary osteoblasts during 2D-clinorotation culture was investigated.Cultured rat primary osteoblasts were obtained and identified by using alkaline phosphatase staining and alizarin red staining methods.Clinostat were used to simulate microgravity，and the effects of astragaloside Ⅳ combined with vitamin D3 at different concentration ratios on proliferation of rat primary osteoblasts were studied by MTT assay and cell counting method.Results showed that,during normal culture,the proliferation of rat primary osteoblasts was significantly increased by treating with astragaloside Ⅳ or vitamin D3，and the optimal concentration was 1×10-7mol·L-1astragaloside Ⅳ or 1×10-8mol·L-1vitamin D3，respectively.Moreover，the proliferative effect was further enhanced when osteoblasts were treated with astragaloside Ⅳ(1×10-7mol·L-1) combined with vitamin D3 (1×10-9mol·L-1or 1×10-8mol·L-1),and the relative proliferation rate was 200% and 196%,respectively.During 2D-clinorotation culture，the proliferation of rat primary osteoblasts were significantly increased by mixed solutions of astragaloside Ⅳ combined with vitamin D3 at different concentration ratios and the optimal conditions were 1×10-7mol·L-1astragaloside Ⅳ combined with 1×10-9mol·L-1vitamin D3.

Keywords：astragaloside Ⅳ;vitamin D3;osteoblasts;2D-clinorotation culture;simulated microgravity;cell proliferation

中圖分類號：R 332R 282.71R 329.24

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)02-0031-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.02.006

作者簡介：王婷梅(1986-)，女，青海人，博士研究生，研究方向：航天醫學，E-mail：tingting_student@163.com；通訊作者：曲麗娜，研究員，E-mail：linaqu@263.net；李瑩輝，研究員，E-mail：yinghuidd@vip.sina.com。

收稿日期：2015-10-21

基金項目：國家科技重大專項重大新藥創制資助項目(2012ZX09J12201)，國家重大科學儀器設備開發專項項目(2013YQ19046706，2012YQ0401400901)