補腎中藥體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化的Meta分析

喬利軍，侯凌波，溫萬鑫，袁龍健，招遠祺

(1廣東省中醫院·廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州510120；2廣州中醫藥大學)

?

補腎中藥體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞分化的Meta分析

喬利軍1，侯凌波2，溫萬鑫1，袁龍健1，招遠祺1

(1廣東省中醫院·廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州510120；2廣州中醫藥大學)

摘要：目的系統評價補腎中藥體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向神經樣細胞分化的能力。方法 計算機檢索PubMed、EMBASE、The Cochrane Library、Ovid、中國生物醫學文獻、中國知網、萬方、維普、全國優秀碩士博士論文數據庫從建庫至2015年7月有關補腎中藥誘導大鼠BMSCs向神經樣細胞分化的實驗研究，以補腎中藥作為誘導劑的為實驗組，以空白對照成公認的干細胞神經為誘導劑作為對照組。采用Cochrane Handbook5.1.0對納入的研究進行質量評價，用RevMan5.3軟件進行Meta分析。結果最終納入12篇文獻。與對照組比較，補腎中藥能明顯提高實驗組神經上皮干細胞蛋白[MD=20.68，95% CI(16.55,24.82)，P<0.01]、神經元細胞特異性標志神經絲蛋白[MD=59.98，95% CI(48.80,71.15)，P<0.01]、神經元特異性烯醇化酶[MD=26.64，95% CI(8.08,45.20)，P<0.01]陽性細胞的表達率，降低膠質纖維酸性蛋白[MD=-17.49，95% CI(-33.90,-1.07)，P<0.01]陽性細胞的表達率。結論 補腎中藥可以有效地體外誘導大鼠BMSCs分化為神經干細胞(NSCs)，并進一步促進NSCs向神經元分化，抑制NSCs向神經膠質細胞分化。

關鍵詞：補腎中藥；骨髓間充質干細胞；神經分化；Meta分析；大鼠

研究發現，骨髓間充質干細胞(BMSCs)無論是體內注射[1]，還是經特殊條件下體外誘導[2]，大部分可分化為神經樣細胞，其向神經細胞分化潛能為神經損傷的修復提供了新的干細胞來源。補腎中藥具有補腎填精、充養腦髓的作用，對神經系統疾病的治療療效顯著，以補腎中藥作為誘導劑來誘導BMSCs向神經樣細胞分化的研究取得一定成效。本研究于2015年7月檢索具有補腎功效的任何劑型中藥(包括有效成分、單體及復合制劑等)誘導BMSCs向神經樣細胞分化的相關資料，系統評價補腎中藥誘導BMSCs向神經樣細胞分化的能力。

1材料與方法

1.1文獻檢索策略檢索年限從建庫至2015年7月。以bone marrow mesenchymal stem cells、bone marrow-derived mesenchymal stem cells、BMSCs、rat、neuron like cells、nerve、neuranagenesis、Chinese herb為英文檢索詞，以骨髓間充質干細胞、大鼠、神經樣細胞、神經分化、中藥為中文檢索詞，補腎中藥包括鹿茸、巴戟天、淫羊藿、杜仲、續斷、肉蓯蓉、補骨脂、鎖陽、菟絲子、地黃、枸杞、何首烏、龜板等，參照各中藥單體及有效成分英文譯名，分別與中英文檢索詞配合檢索，計算機檢索PubMed、EMBASE、The Cochrane Library、Ovid、中國生物醫學文獻數據庫、中國知網、萬方、維普、全國優秀碩士博士論文數據庫。

1.2文獻納入與排除標準納入標準：①研究對象為大鼠的骨髓間充質干細胞；②采用隨機對照設計方案；③實驗組采用任何劑型的補腎中藥(中藥有效成分、單體或復合制劑，主治功效以補腎填精為主)作為誘導劑，對照組為空白對照或公認的干細胞神經誘導劑，誘導方法、誘導時間不限。排除標準：①大鼠骨髓來源以外的其他類型的間充質干細胞，如人骨髓間充質干細胞、小鼠骨髓間充質干細胞、羊骨髓間充質干細胞等；②未提供原始數據或資料不完整；③重復發表的研究。

1.3觀察指標反映神經樣細胞增殖、分化的指標，如神經上皮干細胞蛋白(Nestin)、神經元細胞特異性標志神經絲蛋白(NF)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)。

1.4資料提取由兩位評價人員各自獨立提取資料，有意見分歧時討論解決，必要時與第三方討論確定。使用Endnote X6管理文獻，合并檢索結果并剔除重復文獻，通過閱讀題目及摘要排除明顯不相關文獻，再閱讀全文進一步篩選出符合納入與排除標準的文獻。用Excel2010軟件制定資料提取表，提取內容包括：題目、作者姓名、發表日期、文獻來源、研究方法、實驗組和對照組的干預措施、結局指標及結果等。實驗組數據涉及不同劑量者，以高濃度組數據為最終提取數據。文獻中未提供的數據，通過與文獻作者聯系獲取。

1.5文獻質量評價對納入的原始研究進行方法學質量評價。評價標準參照Cochrane Handbook5.1.0及相關文獻[3]，包括研究目的、研究分組、研究方法、數據分析、結果評價五部分內容。評價結果分為三個等級，Ⅰ級：所有5條質量評價標準均完全滿足且方法正確，則該研究存在各種偏倚的可能性小；Ⅱ級：如果其中任一條為部分滿足(不清楚)，則該研究存在相應偏倚的中等程度可能性；Ⅲ級：只要其中任一條評價標準未做，則該研究存在高度偏倚的可能性。

1.6統計學方法采用RevMan5.3軟件進行Meta分析。對計量資料，測量方式與表達相同時采用均數差(MD)，測量尺度不同或者研究間結果變量高度不一致時采用標準化均數差。各效應量均以點估計和95%可信區間(95%CI)表達；用Q檢驗估計是否存在異質性(檢驗水平為α=0.1)。采用I2對異質性進行定量分析(檢驗水平為50%)。當各研究間無臨床異質性但有統計學同質性時(P>0.1，I2<50%)，采用固定效應模型進行Meta分析；當各研究間存在統計學異質性時(P≤0.1，I2>50%)，分析其異質性來源，進行亞組分析；當各研究組存在統計學異質性而無臨床異質性時，采用隨機效應模型進行分析，并作敏感性分析檢驗結果的可靠性；如果研究數據不能進行Meta分析時，則只對其進行描述性分析。

2結果

2.1納入文獻的基本資料共檢索出文獻514篇，均為中文文獻，符合納入標準的12篇[4~15]。12篇文獻中涉及5類具有補腎功效的中藥單體(地黃多糖[6，7]、枸杞多糖[8，9]、鹿茸精[11]、鹿茸多肽[12]、肉蓯蓉總苷[14])、2類單味中藥(龜板[4,13]、鎖陽[15])、2類復方制劑(補腎益腦膠囊[5]、三甲復脈湯[10])。納入的12篇文獻中Ⅰ級2篇[6，15]、Ⅱ級7篇[4，7~10，13，14]、Ⅲ級3篇[5，11，12]。3篇文獻[5,11,12]對照組的結果僅描述為陰性。

2.2補腎中藥誘導BMSCs增殖的效應5篇研究[4,6，8，14，15]報告了Nestin的表達情況，其研究結果有異質性(P<0.01，I2=96%)，采用隨機效應模型分析結果顯示，兩組差異有統計學意義[MD=20.68，95%CI(16.55,24.82)，P<0.01]，表明相對于對照組，補腎中藥能顯著提高Nestin陽性細胞的表達率。

2.3補腎中藥誘導BMSCs向神經元分化的效應8篇研究[5,7~13]報告了NF的表達情況，但其中3篇研究[5，11，12]對照組結果均僅描述為表達陰性，未獲得具體數據，未能納入Meta分析。對另外5篇研究采用隨機效應模型分析(P<0.01，I2=98%)，結果顯示補腎中藥能顯著提高NF陽性細胞表達率[MD=59.98，95%CI(48.80,71.15)，P<0.01]。另有3篇研究[6，14，15]以NSE作為神經元標記物，并報告了其表達情況，其研究結果間有異質性(P<0.01，I2=100%)，采用隨機效應模型分析，結果顯示兩組差異有統計學意義[MD=26.64，95%CI(8.08,45.20)，P<0.01]，表明相對于對照組，補腎中藥能顯著提高NSE陽性細胞表達率。

2.4補腎中藥誘導BMSCs向神經膠質細胞分化的效應11篇研究[4~13，15]以GFAP作為BMSCs向神經膠質細胞分化的觀測指標，但其中8篇研究[4，5，8-13]均報告為GFAP陰性表達，未提供具體數據，僅3篇研究[6，7，15]最終納入Meta分析。各研究間有異質性(P<0.01，I2=100%)，采用隨機效應模型分析，結果顯示補腎中藥明顯降低GFAP陽性細胞表達率[MD=-17.49，95%CI(-33.90,-1.07)，P<0.01]。

3討論

BMSCs是從骨髓中提取的成體干細胞，具有高度自我更新能力及跨胚層多向分化潛能。細胞因子、細胞共培養、核酸及衍生物和中藥及其提純物是最常用于誘導BMSCs向神經樣細胞分化的方法[16]，誘導方法的不同導致BMSCs在體外分化成神樣經細胞的比例也不一樣。細胞的增殖和分化受各種細胞因子及細胞微環境的影響，并有多種核酸及衍生物參與其信號轉導過程，然而BMSCs向神經元樣細胞分化的比例仍然較低。中醫藥治療強調整體觀念，中藥或可直接作用于干細胞，促進其增殖、分化，或可影響干細胞所處的微環境，促進其存活與功能建立，或可調整機體免疫，減輕免疫排斥反應，研究證實多種中藥可以誘導BMSCs分化為神經樣細胞。

本研究采用系統評價和Meta分析的方法，從神經干細胞(NSCs)增殖、神經元與神經膠質細胞分化等方面評估了補腎中藥誘導BMSCs向神經樣細胞分化的能力，研究結果顯示：與對照組相比，補腎中藥誘導BMSCs分化為NSCs，并進一步促進NSCs向神經元分化，抑制NSCs向神經膠質細胞分化。

補腎填精益髓是建立在中醫辨證論治理論下中樞神經系統疾病的重要治則之一，因此補腎中藥對中樞神經系統疾病的作用也日益受到研究者的重視[17]。《黃帝內經》對腦的生成做了準確描述，《靈樞·經脈》曰“人始生，先成精，精成而腦髓生”。腎者，主藏精，主骨生髓。《醫學衷中參西錄·醫論》“腦為髓海，乃聚髓處，非生髓之處，究其本源，實由腎中真陰真陽之氣，醞釀化合而成，緣督脈上升而貫注于腦”，說明腎精為腦的發生、形成提供了物質基礎。若腎精不足，髓海空虛，則“腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”(《靈樞·海論》)。隨著NSCs研究的深入及中醫學“腎精”學說的發展，腎精與NSCs之間有著非常密切的關系，腎精生髓充腦的作用可能是通過NSCs實現的[18]。BMSCs來源于骨髓，它既具有精、髓、血的特性，又有化生其他物質的功能，因而采用補腎填精益髓法促進其向神經樣細胞分化具有可行性。

本研究所納入的文獻是基于細胞實驗的基礎研究，無規范的實驗設計和質量評價標準，加之納入的文獻均為非盲法檢測，結果可能出現測量性偏倚。納入文獻的質量，大多為Ⅱ級，存在高度偏倚可能，評價結論僅供參考。在本研究的Meta分析中，雖已對各研究指標(Nestin、NF、NSE及GFAP)進行亞組分析，但各組內仍存在較大的異質性，詳細閱讀各研究的實驗方案，筆者認為補腎中藥品種的不同或許是異質性產生的最主要原因，而BMSCs來源、培養與擴增時所選用的培養基、傳代數目、補腎中藥誘導時間、補腎中藥誘導劑量等影響因素同樣可導致實驗的異質性，可能會對實驗結果有一定影響，亦是今后需要深入研究的難點。另外，本研究所納入的文獻均是基于細胞實驗的基礎研究，由于基礎研究的自身特殊性，目前尚缺乏規范的細胞實驗Meta 分析的方法學研究，建立并不斷完善細胞實驗研究文獻檢索和質量評價體系，規范細胞實驗研究的實驗設計，增強其科學性、實用性及與臨床研究的可比性是目前亟待解決的問題。

現有研究表明，補腎中藥可以有效地體外誘導BMSCs分化為NSCs，并進一步促進NSCs向神經元分化，抑制NSCs向神經膠質細胞分化，對進一步開展在體動物實驗研究及臨床研究有指導意義。但受納入研究質量所限，本研究結論尚需更多高質量的研究加以驗證。

參考文獻：

[1] Dong Y, Yang L, Yang L, et al. Transplantation of neurotrophin-3-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for the repair of spinal cord injury[J]. Neural Regen Res, 2014,9(16):1520-1524.

[2] Guan M, Xu Y, Wang W, et al. Differentiation into neurons of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Eur Cytokine Netw, 2014,25(3):58-63.

[3] 張春桃,單娟,馮莉,等.移植排斥治療中不同免疫抑制劑對調節性T細胞活化及功能的影響：結合基礎和臨床的系統評價[J].中國循證醫學雜志,2010,10(6):740-748.

[4] 張進,徐志偉.補腎法誘導間充質干細胞向神經方向分化研究[J].現代醫院,2004,4(9):15-17.

[5] 彭志強,黃天華,郭杵強,等.補腎益腦膠囊將大鼠骨髓間質干細胞誘導為神經細胞的研究[J].中醫臨床研究,2014,6(12):34-36.

[6] 杜紅陽,付海燕,包翠芬,等.地黃多糖對大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞誘導分化作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(6):133-137.

[7] 蔡光先,林琳,劉柏炎,等.地黃多糖誘導骨髓間充質干細胞分化為神經樣細胞的效應[J].中國臨床康復,2005,9(17):46-47.

[8] 劉霞,單偉,曾瑞霞,等.枸杞多糖誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞的分化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(14):2667-2672.

[9] 劉樹輝,馬云勝,曹中偉,等.枸杞多糖誘導大鼠骨髓間充質細胞向神經元樣細胞轉化的實驗研究[J].華北煤炭醫學院學報,2006,8(3):281-283.

[10] 鄺學媚,廖欣,杜少輝,等.三甲復脈湯含藥血清體外誘導成年大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元[J].中國臨床康復,2005,9(30):53-55.

[11] 趙漢寧.鹿茸精誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞[J].現代醫藥衛生,2007,23(1):3-5.

[12] 陳東,孟曉婷,劉佳梅,等.鹿茸多肽對胎大鼠腦神經干細胞體外誘導分化的實驗研究[J].解剖學報,2004,35(3):240-243.

[13] 陳東風,杜少輝,李伊為,等.龜板含藥血清體外誘導成年大鼠骨髓間充質干細胞分化為神經元[J].廣州中醫藥大學學報,2003,20(3):224-226.

[14] 董亞莉,李劍鋒.不同質量濃度肉蓯蓉總苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞樣細胞的定向分化[J].中國組織工程研究,2012,16(1):103-106.

[15] 劉凱,吳建軍.鎖陽含藥血清對骨髓間質干細胞向神經細胞分化的影響[J].中醫研究,2010,23(5):24-27.

[16] Scuteri A, Miloso M, Foudah D, et al. Mesenchymal stem cells neuronal differentiation ability: a real perspective for nervous system repair[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2011，6(2):82-92.

[17] 林琳,蔡光先.補腎中藥對神經系統作用的研究進展[J].湖南中醫雜志,2004,20(1):66-67.

[18] 王康鋒,張洪斌,張立娟.中醫腎精理論與神經干細胞關系探討[J].新中醫,2005,37(12):76-77.

(收稿日期：2015-11-11)

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0026-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.009

通信作者：招遠祺(E-mail:tcm2008@126.com)

基金項目：廣東省自然科學基金資助項目(2015A030310436)；廣東省中醫藥管理局科研項目(20151210)。