基因芯片快速檢測(cè)結(jié)核分歧桿菌耐藥性的效能分析

王金富, 戴　潔, 曾方林, 吳　敏

(1. 江蘇省揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;2. 江蘇省揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225003)

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基因芯片快速檢測(cè)結(jié)核分歧桿菌耐藥性的效能分析

王金富1, 戴潔1, 曾方林1, 吳敏2

(1. 江蘇省揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;2. 江蘇省揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225003)

基因芯片; 結(jié)核分歧桿菌; 耐藥檢測(cè)

耐藥結(jié)核分歧桿菌較敏感結(jié)核分歧桿菌有更高的致死率和發(fā)病率[1]。通過檢測(cè)結(jié)核分歧桿菌(MTB)的耐藥基因是否發(fā)生突變，可以推斷MTB的耐藥性。常用的耐藥基因檢測(cè)技術(shù)有基因芯片技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)技術(shù)。晶芯試劑盒是利用基因芯片技術(shù)對(duì)臨床常見的結(jié)核分歧桿菌的INH耐藥基因katG、inhA和RFP耐藥基因ropB進(jìn)行檢測(cè)，從而推斷MTB是否對(duì)INH和RFP耐藥。本研究以傳統(tǒng)MTB藥敏試驗(yàn)(比例法)為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)基因芯片的應(yīng)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2015年10月—2016年3月本院就診患者中抗酸分歧桿菌涂片陽性標(biāo)本96例，去除經(jīng)培養(yǎng)鑒定為非結(jié)核分歧桿菌的2例，共計(jì)94例。

1.2儀器與試劑

傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)(比例法)固體培養(yǎng)基由珠海貝索生物有限公司提供；晶芯基因芯片檢查系統(tǒng)和配套試劑由北京博奧生物有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)(比例法)：嚴(yán)格按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)程》開展。基因芯片：用晶芯核酸提取儀提取核酸，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用雜交緩沖液處理后在芯片雜交儀上進(jìn)行雜交，再用芯片洗干儀進(jìn)行洗滌和甩干，最后用芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行掃描和結(jié)果判讀，并記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異性應(yīng)用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)判別(P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)判別(Kappa≥0.75表示一致性較好, Kappa≥0.4～<0.75表示一致性一般, Kappa<0.4表示一致性較差)。

2　結(jié)　果

① INH基因芯片法檢測(cè)效能分析顯示，敏感性為89.2%(25/28)，特異性為98.4%(65/66)，陽性預(yù)示值為96.2%(25/26)，陰性預(yù)示值為95.6%(65/68)，準(zhǔn)確度為95.7%(90/94)；差異性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一致性比較結(jié)果顯示較好。② RFP基因芯片法檢測(cè)效能分析顯示，敏感性為81.4%(22/27)，特異性為96.8%(65/67)，陽性預(yù)示值為91.7%(22/24)，陰性預(yù)示值為92.9%(65/70)，準(zhǔn)確度為92.6%(87/94)；差異性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一致性比較結(jié)果顯示較好。③ 耐多藥基因芯片法檢測(cè)效能分析顯示，敏感性為83.3%(20/24)，特異性為98.6%(69/70)，陽性預(yù)示值為95.2%(20/21)，陰性預(yù)示值為94.6%(69/73)，準(zhǔn)確度為95.7%(89/94)；差異性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一致性比較結(jié)果顯示較好。④ 基因芯片檢測(cè)報(bào)告時(shí)間為(3.6±1.5) d, 傳統(tǒng)藥敏報(bào)告時(shí)間為(69.1±5.9) d。

3　討　論

基因芯片具有高通量、大規(guī)模、高度并行性、快速高效、高靈敏、高度自動(dòng)化等特點(diǎn)。基因芯片通過對(duì)INH耐藥基因katG、inhA和RFP耐藥基因ropB常見突變位點(diǎn)檢測(cè)，從而判定MTB是否對(duì)INH和RFP耐藥。本研究中，基因芯片檢測(cè)INH耐藥性的敏感性為89.2%，特異性為98.4%，基因芯片檢測(cè)RFP耐藥性的敏感性為81.4%，特異性為96.8%，說明以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)的敏感性和特異性均較好，與趙冰[2]、何建[3]等研究結(jié)果相似，比梁桂亮[4]、劉晶波[5]等研究的檢測(cè)敏感性要低一些。說明基因芯片檢測(cè)MTB耐藥性的敏感性和特異性均較好。

比例法被WHO列為MTB藥敏試驗(yàn)的推薦方法，也被作為驗(yàn)證其他檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。但比例法耗時(shí)較長(zhǎng)，需要8～10周才能出結(jié)果，往往耽誤了耐藥結(jié)核患者的診治。本研究中，基因芯片報(bào)告時(shí)間平均是3.6 d, 較比例法的平均69.1 d縮短了65.5 d。《全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃(2016-2020年)》(征求意見稿)中明確指出積極推廣MTB耐藥快速檢測(cè)技術(shù)，可縮短診斷時(shí)間。

基因芯片只檢測(cè)INH的Kate和InhA基因, INH耐藥經(jīng)常是由這兩個(gè)基因突變導(dǎo)致的，但有研究[7-10]表明20%左右耐INH分離株的2個(gè)基因均無變化，可能由其他的耐藥機(jī)制引起，所以在進(jìn)行INH耐藥檢測(cè)會(huì)引起部分耐INH的MTB的漏檢。雖然絕大多數(shù)的RFP耐藥是由rpoB基因突變引起的[11-14]，但基因芯片檢測(cè)的是rpoB基因熱點(diǎn)區(qū)域部分主要密碼子突變，可能會(huì)引起少量漏檢。某些情況下，即使檢測(cè)出耐藥基因也未必一定會(huì)引起結(jié)核分歧桿菌耐藥[15-17]。基因芯片檢測(cè)RFP時(shí)，檢測(cè)到2例密碼子533 (CTG→CCG)突變，但比例法檢測(cè)均為敏感，可能是因?yàn)?33位密碼子突變一般會(huì)引起低水平耐藥[18-19]。檢測(cè)到密碼子533 (CTG→CCG)突變的MTB是否需要按照耐RFP進(jìn)行處理，需要進(jìn)一步的研究。

本研究表明，基因芯片檢測(cè)對(duì)于MTB的INH、RFP耐藥性檢測(cè)方面有較高的敏感性和特異性，并且檢測(cè)速度更快。

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2016-05-27

R 378.91

A

1672-2353(2016)19-081-02DOI: 10.7619/jcmp.201619024