不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化與蛋白表達及臨床病理特征的關系

張順禮, 胡繼衛, 馬　杰, 張景華, 王　宇, 谷　崢, 陳晶晶

(河北省唐山市人民醫院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)

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不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化與蛋白表達及臨床病理特征的關系

張順禮, 胡繼衛, 馬杰, 張景華, 王宇, 谷崢, 陳晶晶

(河北省唐山市人民醫院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)

摘要:目的探討不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化與蛋白表達及臨床病理特征的關系。方法PCR法檢測55例乳腺浸潤型導管癌組織中p16基因甲基化情況，免疫組化法檢測p16蛋白表達情況，分析p16基因甲基化與蛋白表達及臨床病理特征的關系。結果55例標本中，共12例(21.82%)發生p16基因甲基化，21例(38.18%)p16蛋白表達陽性，其中基底樣型基因甲基化發生率顯著高于Luminal A型(P<0.05)，蛋白表達陽性率顯著低于Luminal A型(P<0.05)。發生基因甲基化的組織中p16蛋白陽性表達率為16.67%，未發生甲基化的組織中陽性表達率為44.19%，差異有統計學意義(P<0.05)。組織學分級Ⅱ～Ⅲ級、伴淋巴結轉移及ER蛋白表達陰性的組織中甲基化發生率高于組織學Ⅰ級、無淋巴結轉移及ER蛋白表達陽性的組織(P<0.05)。結論p16基因甲基化可能是基底樣型乳腺癌的重要分子特征之一，且與乳腺癌的病情進展有關，可能成為預后評估及靶向治療的重要指標。

關鍵詞:乳腺癌; 基底樣型乳腺癌; 抑癌基因p16; 甲基化

It is also valuable to disease prognosis and gene targeted therapy.

乳腺癌發生發展涉及多個基因的異常表達，DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印跡及非編碼RNA調控等表觀遺傳的改變在基因異常表達中起關鍵作用，尤其是DNA甲基化可抑制抑癌基因轉錄導致其表達缺失，促進惡性腫瘤的發生與進展[1-2]。抑癌基因p16編碼蛋白可抑制細胞周期進展，是重要的細胞周期負向調控因子[3]。p16基因的變異形式包括點突變、甲基化及基因缺失，其中DNA甲基化是其基因失活的最重要機制，且甲基化通常在組織惡變之前就已經發生，對癌前病變的早期診斷具有重要意義。大量研究[4-6]表明，p16基因甲基化在肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤發生發展中發揮了重要作用，可作為疾病進展的預測指標之一。本研究通過檢測不同分子亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達的情況并探討其相關性，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年5月—2015年5月河北省唐山市人民醫院收治的乳腺癌患者55例，納入標準: ① 符合相關指南[7]標準，經病理學檢查確診為浸潤型導管癌; ② 術前未接受放、化療。患者均為女性，年齡39～60歲，中位年齡50歲；組織學分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級22例，Ⅲ級15例；分子亞型：基底樣型10例, Luminal A型16例, Luminal B型14例，HER-2過表達型15例。收集55例患者的乳腺癌標本組織待測。本研究經醫院倫理學委員會批準，患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑: ① 主要儀器。PCR擴增儀, Oplympus全自動顯微鏡掃描系統，凝膠成像分析系統，低溫高速離心機等。② 主要試劑。p16抗體，石蠟組織DNA提取試劑盒鏈霉卵白素(SP)試劑盒，DNA甲基化修飾試劑盒，DNA甲基化PCR試劑盒，甲基聯苯胺(DAB)試劑等。

1.2.2PCR法檢測p16基因啟動子甲基化狀態：所有標本均經福爾馬林固定后石蠟包埋，HE染色。石蠟組織連續切片后按說明書提取基因組DNA，以紫外分光光度儀檢測其水平及純度。DNA經修飾后，未甲基化的胞嘧啶(C)變為尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(Cm)無改變。修飾后的DNA行PCR擴增，甲基化引物片段為150 bp，未甲基化引物片段150 bp。

1.2.3免疫組化SP法檢測p16蛋白表達：組織切片脫蠟至水，抗原修復后采用雙氧水孵育，血清封閉，滴加p16抗體，PBS沖洗3次，滴加二抗后繼續孵育，滴加SP顯色。

1.3判定標準

甲基化判定標準：在凝膠成像分析系統下觀察DNA擴增產物，出現150 bp產物為基因甲基化，出現151 bp產物為未發生甲基化。

蛋白表達結果判定標準[8]：細胞核和細胞漿均出現棕黃色顆粒為陽性，于高倍鏡下隨機數10個視野觀察，綜合染色強度及陽性細胞占腫瘤細胞的比例2項指標進行計分，2項分值乘積>3分判為陽性。

1.4統計學處理

采用SPSS 19.0軟件，定性資料采用百分比表示，采用卡方檢驗；定量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達的情況

55例標本中，共12例(21.82%)發生p16基因甲基化。基因甲基化發生率在Luminal A型、Luminal B、HER-2過表達型及基底樣型中分別為12.50%(2/16)、21.43%(3/14)、20.00%(3/15)及40.00%(4/10)，其中基底樣型基因甲基化發生率顯著高于Luminal A型(P<0.05)。

55例標本中，出現p16蛋白陽性21例(38.18%)，p16蛋白在細胞核、細胞漿內呈現不均勻染色，見圖1。在Luminal A型、Luminal B、HER-2過表達型及基底樣型p16蛋白陽性率分別為50.00%(8/16)、42.86%(6/14)、33.33%(5/15)及20.00(2/10)，其中基底樣型p16蛋白陽性率顯著低于Luminal A型(P<0.05)。

2.2p16基因甲基化與蛋白表達的關系

12例發生p16基因甲基化的標本中，2例(16.67%)表達p16蛋白，10例(83.33%)未表達；43例未發生基因甲基化的標本中，19例(44.19%)表達p16蛋白，24例(55.81%)未表達。發生基因甲基化與未發生的組織中p16蛋白陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3p16基因甲基化與臨床病理特征的關系

分析p16基因甲基化與乳腺癌患者臨床病理特征的關系，不同患者年齡、腫瘤直徑及PR蛋白表達的組織中p16基因甲基化發生率差異無統計學意義(P>0.05)；組織學分級Ⅱ～Ⅲ級、伴淋巴結轉移及ER蛋白表達陰性的組織中甲基化發生率顯著高于組織學Ⅰ級、無淋巴結轉移及ER蛋白表達陽性的組織(P<0.05)。見表1。

與同一病理特征的另一亞項比較, *P<0.05。

3討論

乳腺癌的分子發病機制尚未完全明確，其發生發展是一個多基因共同協作的漸進累積過程，表觀遺傳機制在此過程中發揮重要作用。DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要內容，為乳腺癌的早期診斷與靶向治療提供了新思路。抑癌基因p16屬于周期依賴性激酶抑制因子基因家族，其編碼的蛋白可調節細胞周期[9]，阻止DNA損傷的細胞發生分裂和增殖；p16基因信號通路在不同亞型乳腺癌發生發展中可能發揮不同作用[10]。近年來研究[11]表明，p16基因啟動子CpG島甲基化后發生基因沉默，細胞出現生存優勢，直接促進腫瘤的發生與發展。

目前，p16基因甲基化在乳腺癌發生發展中的作用報道[12]較多，但大多集中于癌癥組織與良性病變組織中甲基化情況的對比；關于不同分子亞型乳腺癌組織中基因甲基化的研究方面，則多集中于SFRP1等其他基因[13]，偶見全基因組甲基化及基因表達概況的研究[14]。本研究檢測了55例不同分子亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達情況，結果表明，基底樣型乳腺癌組織中p16基因甲基化發生率最高，蛋白表達陽性率最低，提示基底樣型乳腺癌組織中p16基因的表達情況較為特殊，p16基因啟動子甲基化可能在基底樣型乳腺癌發生發展中發揮更為重要的作用。ER、PR蛋白陽性表達的乳腺癌患者對內分泌治療較為敏感，且預后較好，目前關于這2種蛋白與p16基因甲基化的相關性尚存在爭議[8]。本研究進一步分析p16基因甲基化與臨床病理特征的關系發現，ER表達陽性患者p16基因甲基化發生率低于陰性患者，提示兩者可能存在負相關，與Tao等[15]報道一致；而PR蛋白表達情況與p16基因甲基化無明顯相關性，與李莉等[16]報道一致。此外，乳腺癌的組織學分級淋巴結轉移情況是判定預后的重要指標，本研究發現，組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級，以及伴淋巴結轉移的乳腺癌組織中p16基因甲基化的發生率更高，提示p16基因甲基化與病情進展有關，可能成為預測乳腺癌預后的參考指標，與Barekati[17]、聶艷紅等[18]報道一致。

綜上所述，基底樣型乳腺癌組織中p16基因甲基化發生率高于其他分子亞型，蛋白表達率低于其他分子亞型。此外，p16基因甲基化與乳腺癌病情進展密切相關，可能成為預后評估及靶向治療的參考指標。

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Methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics

ZHANG Shunli, HU Jiwei, MA Jie, ZHANG Jinghua, WANG Yu,GU Zheng, CHEN Jingjing

(DepartmentofBreastSurgery,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001)

KEYWORDS:breast carcinoma; basal-like breast carcinoma; p16 gene; methylation

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics. MethodsMethylation-specific PCR was applied to detect methylation of p16 gene promoter and immune-histochemistry technique was used to detect p16 protein expression in 55 tissue samples of invasive ductal breast cancer. The relationship between methylation of p16 gene promoter and p16 protein expression and clinic pathological characteristics was analyzed. ResultsOut of 55 tissue samples, there were 12 cases (21.82%) with positive outcome in methylation and 21 cases (38.18%) with positive protein expression respectively. The methylation rate of p16 gene promoter was significantly higher and positive expression rate of p16 protein was significantly lower in those diagnosed as basal-like breast carcinoma than those as luminal A subtypes breast carcinoma (P<0.05). The positive expression rate of p16 protein was 16.67% in those with positive methylation and was 44.19% in those with negative methylation (P<0.05). The incidence rate of p16 gene promoter methylation was significantly higher in tissue samples with histological gradeⅡ～Ⅲ, lymph node metastasis, ER-negative than those with histological gradeⅠ, non-lymph node metastasis, ER-positive (P<0.05). ConclusionThe methylation of p16 gene promoter, as an important molecular feature to basal-like breast carcinoma, is potentially associated with disease progression.

收稿日期:2016-03-10

通信作者:張景華, E-mail: JHZH2010@163. com

中圖分類號:R 737.9

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)11-047-03

DOI:10.7619/jcmp.201611014