支氣管哮喘與糖皮質激素受體基因bcl-I單核苷酸多態性的關系

云哲琳, 王冬梅, 曲艷杰

(1. 內蒙古醫科大學第三附屬醫院, 內蒙古 包頭, 014010;2. 內蒙古自治區包頭市第四醫院, 內蒙古 包頭, 014030)

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支氣管哮喘與糖皮質激素受體基因bcl-I單核苷酸多態性的關系

云哲琳1, 王冬梅2, 曲艷杰2

(1. 內蒙古醫科大學第三附屬醫院, 內蒙古 包頭, 014010;2. 內蒙古自治區包頭市第四醫院, 內蒙古 包頭, 014030)

摘要:目的研究糖皮質激素受體(GR)基因bcl-I單核苷酸多態性與兒童支氣管哮喘的相關性及其與血漿皮質醇濃度的關系。方法 應用聚合酶鏈反應和限制性長度片段多態性(PCR-RFLP)的方法對76例哮喘兒童和50例健康兒童行糖皮質激素受體基因bcl-I單核苷酸多態性的檢測。應用放射免疫法對2組兒童行血漿皮質醇濃度的測定。結果GR基因bcl-I位點在2組中發現3種基因型的存在，分別為CC純合型，GG純合型和CG雜合型。CC, CG, GG型頻率在哮喘發作組中分別為48.7%, 27.6%, 23.7%，在健康對照組中分別為76%，20%，4%，差異有統計學意義(P<0.05)。G等位基因的頻率在哮喘發作組為37.5%, 顯著高于對照組的14%，表明G等位基因與哮喘存在相關性。結論GR基因bcl-I單核苷酸多態性與哮喘的發病存在相關性。等位基因G可能為哮喘激素抵抗的易感基因。激素抵抗與血漿皮質醇濃度無關。

關鍵詞:支氣管哮喘；糖皮質激素受體；基因多態性；激素抵抗

支氣管哮喘是兒童時期的常見病與多發病，它是由多種細胞(如肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。糖皮質激素(GC)作為臨床治療哮喘的主要藥物之一，可以明顯改善患者喘息、咳嗽、咳痰等癥狀，提高哮喘患者的生存質量。但有部分患者即使長期或大劑量給予激素，其療效仍不理想，稱為激素抵抗型哮喘[2]。糖皮質激素發揮藥理、生理等效應需要糖皮質激素受體(GR)來介導。GR基因位于5q1-3，研究[3]表明5號染色體長臂(5q)上分布著眾多的基因，可能在IgE合成的調節和過敏及哮喘相關炎癥的發生發展中起重要作用。作者運用聚合酶鏈-限制性長度片段多態性(PCR-RFLP)技術，測定GR基因bcl-I單核苷酸多態性，探討其與支氣管哮喘發病的關系，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

根據2008年中華醫學會修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[4]的標準，選取2013年10月—2015年10月包頭市第四醫院門診及病房確診的哮喘患兒76例為哮喘組，年齡4～15歲，平均年齡為(8.97±2.93)歲，男54例，女22例。選取同期健康兒童50例為對照組，年齡5～16歲，平均年齡為(9.08±3.00)歲，男35例，女15例。2組年齡、性別無顯著差異(P>0.05)。經患兒及家長同意配合做激素抵抗者44例，口服強的松1 mg/kg，連服7 d。治療前后行肺功能檢測，FEV1改善低于15%為激素抵抗哮喘患兒[5]。

1.2方法

所有研究對象于晨起空腹采集EDTA抗凝外周血2 mL進行細胞和血漿分離，分離后置于-20 ℃冰箱保存。分離出的含有細胞成分的沉淀部分行GR基因bcl-I單核苷酸多態性檢測，血漿部分集中行血漿皮質醇濃度檢測。

糖皮質激素受體基因bcl-I單核苷酸多態性的測定: ① 基因組DNA的提取。從分離出的含有細胞成分的沉淀部分進行單個核細胞提取DNA, -20 ℃保存待檢。② PCR擴增。引物根據參考文獻[6]設計，由生工生物工程(上海)有限公司合成，上游引物為5′-GAGAAATTCACCCCTACCAAC-3′, 下游引物為5′-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3′。反應體系為25 μL, 其中包括10 ×Buffer 2.5 μL、MgCl22.5 μL, dNTP 2.0 μL、上下游引物各1 μL, Taq酶0.25 μL, DNA 3 μL, 雙蒸水12.75 μL。反應條件: 94 ℃預變性5 min, 94 ℃變性45 s, 57 ℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共進行38個循環, 72 ℃延伸5 min。③ PCR產物酶切處理。取PCR擴增產物10 μL, 加bcl-I限制性內切酶1.2 μL, 10×Loading Buffer 2 μL, 蒸餾水7 μL, 37 ℃水浴10 h。④ 電泳。以PCR Markers作為DNA片段的標準參照物，應用2%瓊脂糖(4.0 g/dL)溴乙錠凝膠方法電泳(電壓120 V, 20 min), 在紫外透射自動成像分析儀上進行成像，記錄結果。

血漿皮質醇(Cor)濃度測定采用放射免疫法。分離后的血漿按照人血漿皮質醇濃度試劑盒(由北京北方生物研究所提供)要求行皮質醇濃度的測定。

1.3統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據處理，計數資料間的比較采用卡方檢驗，計量資料采用均值±標準差表示，采用t檢驗和方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

PCR擴增產物電泳結果見圖1。各組基因型及等位基因基因頻率比較見表1。本次PCR擴增產物經電泳分析證實，哮喘兒童中bcl-I基因存在CC純合型、GG純合型、CG雜合型3種基因型。GG基因型在哮喘組中的頻率分布顯著高于對照組(P<0.05); G等位基因的頻率在哮喘組為37.5%，也顯著高于對照組的14%(P<0.05)。說明G等位基因與哮喘的發生存在相關性。2組血漿皮質醇濃度的測定結果見表2。CC組激素敏感例數為19例，激素不敏感例數為4例，激素敏感率為82.61%; GG組和GC組激素敏感例數為6例，激素不敏感例數為15例，激素敏感率為28.57%。CC組激素敏感率顯著高于GG和GC組(P<0.01)。不同激素治療組的皮質醇濃度無顯著差異。見表3。

與對照組比較, *P<0.05。

3討論

3.1GR基因變異對功能的影響

GC的生物學效應需通過GR介導。GR是一種配體激活的內源性轉錄因子，主要位于胞漿內，屬于核受體家族，并已被正式命名為NR3C1(nuclear receptor subfamily 3, group C，member 1)[7]。人類NR3C1共有10個外顯子[8]，第9外顯子處經可變剪接產生兩種同源的mRNA和蛋白質亞型，即GRα和GRβ，GR亞單位與熱休克蛋白90(HSP90)、熱休克蛋白70(HSP70)形成復合物，處于未激活狀態；GC擴散進入胞漿內，并與GR-Hsp結合，同時Hsp被分離。GC和GR復合物進入細胞核，與靶基因啟動子序列的GRE結合，激活或抑制靶基因的轉錄活性，調節蛋白質的合成，此即為GC的“基因組效應機制”[9]。因而GR的基因變異造成的蛋白結構異常或基因表達的改變，將影響受體的數量和結合力，從而影響GC的作用，進而引起激素抵抗。Tuckemann等[10]采用選擇性GR突變小鼠來研究激素的抗炎機制，發現激素受體間存在DNA連接缺失的小鼠顯示了對激素治療的抵抗。多態性的激素受體基因還可以引起相關細胞因子(如IL-4)或各種誘導激素抵抗的關鍵分子的過度表達[11]，這可能跟GC敏感性下降有關。

3.2GR基因bcl-I單核苷酸多態性與哮喘激素抵抗

Hurley等[12]發現，GR基因突變能夠導致家族性糖皮質激素抵抗。有研究證實GR基因突變可引起GR分子結構和功能異常，導致家族性糖皮質激素抵抗或獲得性糖皮質激素耐藥。目前，國內外對GR基因多態性的研究主要集中在bcl-I、ER22/23EK以及N3635這3個多態性上，而且陰陽性結果報道均不少。

bcl-I多態性是指在GR基因外顯子2下游646個核昔酸處有一突變，即C→G(TGATCA→TGATGA)[13]。早在1992年，Weaver等[14]率先對bcl-I多態性進行了研究，發現攜帶該多態性突變基因的純合子組人群空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數均較高。2006年Anja Rogausch等[15]對患有支氣管哮喘、COPD這些氣道阻塞性疾病的患者進行了bcl-I多態性與吸煙行為的研究，發現該多態性的存在與人群對尼古丁的依賴性及其嚴重程度相關。此外，在使用GC治療肺纖維化過程中，患者對GC的治療反應高低不一致，這一事實讓Harriet Corvol等學者們大膽猜測GR基因多態性可能會誘發肺纖維化患者體內炎癥反應過程發生改變，從而影響患者對GC的敏感性。Harriet Corvo1等[16]對255例年輕肺纖維化患者的GR基因4處多態性(即Tthlll、ER22/23EK、N363S和bcl-I)進行檢測并跟蹤觀察各病例的疾病演化進程。結果發現，攜帶bcl-l基因的患者第1秒用力呼氣容積(FEV1)和用力肺活量(FVC)均呈下降趨勢，其中突變基因型純合子組(GG)患者比其他兩種基因組合形式bcl-I-GC、CC的FEV1和FVC下降更明顯，故由實驗結果推測，bcl-I多態性可能與調控纖維化肺組織的炎癥反應有關，干擾GC正常發揮抗炎效應，從而加速肺纖維化患者肺功能的惡化。bcl- I的多態性在體質量指數、血壓、膽固醇水平代謝紊亂和各種機能紊亂中潛在的相關性已被廣泛研究[17-19]。Tadeusz Pietras等[6]就GR激素受體基因bcl-I單核苷酸多態性與哮喘的關系做了初步探索，結果顯示bcl-I的多態性與哮喘抵抗相關。

本研究的76例哮喘兒童中，有44例患兒配合做了激素抵抗的測試，其中19例存在激素抵抗。作者通過進行GR基因bcl-I單核苷酸多態性分析，發現這19例患兒中，有4例表現出CC基因型，其余15例為含G等位基因的GG基因型及CG基因型，而激素抵抗患兒的平均皮質醇濃度并無增高。由此作者分析，等位基因C突變為G, 導致GR結構及功能發生改變，降低糖皮質激素與之結合產生的藥理作用，出現激素抵抗現象。bcl-I單核苷酸多態性不僅與兒童支氣管哮喘的發病有關，等位基因G可能還是激素抵抗的易感基因，該結論與Tadeusz Pietras等[6]研究一致。眾所周知，哮喘的發病是多基因、多因素作用的結果，糖皮質激素受體基因其他位點的基因多態性的存在與哮喘之間的關系尚有待于進一步的探討。這些都有待于以后進一步擴大研究樣本，或多中心，大樣本的研究。

3.3bcl-I單核苷酸多態性與哮喘激素抵抗及血漿皮質醇濃度

皮質醇是一種主要由腎上腺皮質束狀帶分泌的糖皮質激素，屬于21碳類甾體激素。目前臨床上將糖皮質激素抵抗分為原發性糖皮質激素抵抗和獲得性糖皮質激素抵抗，前者多為家族性，以血漿皮質醇水平升高而沒有Cushing綜合征表現，下丘腦-垂體-腎上腺軸對地塞米松抵抗以及GR親和力缺陷為特征。大部分家族性糖皮質激素抵抗患者存在GR基因突變所致的GR功能缺陷。本實驗測定了76例哮喘兒童及50例健康兒童的血漿皮質醇濃度，對實驗結果進行統計分析，發現各組間及各組中不同基因型之間血漿皮質醇濃度無顯著差異，說明患者內源性的皮質激素分泌和代謝功能正常，沒有腎上腺皮質功能不足的臨床特點，也沒有糖皮質激素的吸收障礙、代謝加速、清除加快等表現。這表明哮喘激素抵抗與血漿皮質醇濃度無關，由此作者初步認為GR基因bcl-I單核苷酸多態性是導致哮喘激素抵抗的重要因素，等位基因G可能是哮喘激素抵抗的易感基因。

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Relationship between bronchial asthma and glucocorticoid receptor gene bcl-I single nucleotide polymorphism

YUN Zhelin1, WANG Dongmei2, QU Yanjie2

(1.TheThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou,InnerMongolia, 014010;2.BaotouFourthHospital,Baotou,InnerMongolia, 014030)

KEYWORDS:asthma; glucocorticoid receptor; gene polymorphism; hormonal resistance

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the relationship between bronchial asthma and glucocorticoid receptor gene bcl-I single nucleotide polymorphism and to analyze the relationship between asthma and the plasma cortisol level. MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) techniques were used to determine the bcl-I single nucleotide polymorphism of the glucocorticoid receptor gene in 76 subjects with asthma and 50 normal controls respectively. The plasma cortisol levels were detected by radioimmunoassay in two groups. ResultsThere were three genotypes in bcl-I gene, which were genotype CC, GG and CG. The frequencies of CC, CG, GG genotypes were 48.7%, 27.6%, 23.7% in asthma group and 76%, 20%, 4% in control group, and there were significant differences (P<0.05). Frequency of G allele in asthma group was 37.5%, which was significantly higher than 14% in control group (P<0.05). G allele was associated with asthma. ConclusionThe bcl-I polymorphism of GR gene is significantly associated with bronchial asthma. G Allele may be a risk factor for steroid-resistance. Steroid-resistance is not associated with the plasma cortisol levels.

收稿日期:2015-12-16

基金項目:內蒙古自治區包頭市醫藥衛生科技計劃項目(BK2011265)

通信作者:王冬梅

中圖分類號:R 562.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)11-021-04

DOI:10.7619/jcmp.201611007