蜂膠質(zhì)量控制技術(shù)研究*

文萍　戴希希　劉丹　余良忠#（江西省中醫(yī)藥研究院　南昌330046；江西省撫州市食品藥品檢驗(yàn)所　江西撫州344000）

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蜂膠質(zhì)量控制技術(shù)研究*

文萍1戴希希2劉丹1余良忠1#
（1江西省中醫(yī)藥研究院南昌330046；2江西省撫州市食品藥品檢驗(yàn)所江西撫州344000）

摘要：目的：建立蜂膠的質(zhì)量控制方法。方法：對(duì)蜂膠的性狀、干燥失重、總灰分、酸不溶性灰分、氧化時(shí)間、乙醇浸出物含量、有毒有害物質(zhì)等進(jìn)行檢查，采用薄層鑒別對(duì)蜂膠進(jìn)行特征性鑒別，并對(duì)蜂膠中總黃酮的含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)研究。結(jié)果：確定了蜂膠各項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)限量；建立了蜂膠總黃酮含量測(cè)定的方法，并測(cè)定了15批蜂膠中總黃酮的含量，確定了含量范圍。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、可靠，可用于蜂膠的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蜂膠；總黃酮；質(zhì)量控制

蜂膠是蜜蜂采集植物樹(shù)脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合，形成的膠粘性物質(zhì)。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，已經(jīng)成為保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，是常用的保健食品原料，已收載于中國(guó)藥典2010年版。其功能為補(bǔ)虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌[1～3]，用于抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、加速組織愈合、高脂血癥和糖尿病的輔助治療[4～6]，但蜂膠尚無(wú)保健食品原料質(zhì)量控制技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。本課題組前期對(duì)蜂膠提取物制備工藝進(jìn)行了研究[7]，同時(shí)收集到有關(guān)部門(mén)頒布的9個(gè)蜂膠的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)主要還是從蜂膠提取物的形態(tài)、色澤、氣味、滋味、總黃酮含量、氧化時(shí)間、乙醇浸出物等指標(biāo)來(lái)控制蜂膠提取物的質(zhì)量，對(duì)蜂膠質(zhì)量控制起到了一定作用，但是僅具有感官和理化指標(biāo)要求是不夠的，缺少特征鑒別和特征成分的含量檢測(cè)指標(biāo)，無(wú)法檢測(cè)出真假，嚴(yán)重影響蜂膠產(chǎn)品的安全性和有效性。本課題組在全國(guó)范圍內(nèi)采（收）集了160多批次合格或不合格的蜂膠原料樣品，及楊樹(shù)膠和造假主要原料楊樹(shù)芽，通過(guò)對(duì)樣品性狀、干燥失重、總灰分、酸不溶性灰分、氧化時(shí)間、乙醇浸出物及有毒有害物質(zhì)的檢查，薄層鑒別和含量測(cè)定的方法的研究及確定，為蜂膠的質(zhì)量控制提供了科學(xué)的依據(jù)。

1　儀器、試藥及試樣

1.1儀器UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津）；TU-1800SPC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）；AG135雙量程十萬(wàn)分之一電子天平（Mettller Tkledo公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.2試藥乙醇、苯、甲醇、磷酸、石油醚（B.P60～90℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲酸（均為分析純）；CG-161M美國(guó)AMBERCHROM色譜樹(shù)脂（北京春達(dá)科技有限公司），聚酰胺薄膜10×20 cm（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠(chǎng)）；硅膠G高效薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.3試樣

1.3.1對(duì)照品白楊素對(duì)照品（批號(hào)：111701-200501），高良姜素對(duì)照品（批號(hào)：111699-200501），喬松素對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707），均由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供。

1.3.2樣品蜂膠為本課題組收集，產(chǎn)地為云南（樣品編號(hào)16、17）、四川（編號(hào)35、37、38）、江西（編號(hào)90、99、103，104，106）、湖南（編號(hào)111，117，119）、山東（編號(hào)128、129）、河南（編號(hào)27、43，45，47）、山西（編號(hào)50、52、57）、內(nèi)蒙（編號(hào)130、134、136）、遼寧（編號(hào)138）、陜西（編號(hào)2、4）、甘肅（編號(hào)10、15）、新疆（編號(hào)31）、浙江（編號(hào)86、87、88、89）等地，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院余良忠研究員鑒定為蜜蜂采集植物樹(shù)脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠粘性物質(zhì)。楊樹(shù)膠（編號(hào)58、59、62、63、64、65、66、153～159）購(gòu)于河南。巴西蜂膠（編號(hào)91號(hào)）、烏拉圭蜂膠由江西汪氏蜜蜂園有限公司提供。

2　方法及結(jié)果

2.1蜂膠性狀根據(jù)95批次樣品的觀(guān)察結(jié)果、口嘗滋味、鼻嗅氣味，再將樣品至烘箱中加熱至30℃以上，觀(guān)察其是否軟化。結(jié)合國(guó)標(biāo)（GBT 24283-2009）蜂膠標(biāo)準(zhǔn)，蜂膠性狀定為：團(tuán)塊狀或不規(guī)則碎塊，呈棕黃色、棕褐色、青綠色或灰褐色，具光澤，10℃以下質(zhì)脆，30℃以上逐漸變軟，氣芳香，無(wú)異味，味微苦，略澀，有辛辣和微麻感。

2.2一般檢查按照中國(guó)藥典2010年版一部蜂膠氧化時(shí)間規(guī)定項(xiàng)下的方法和附錄ⅨG、ⅨK進(jìn)行操作，通過(guò)對(duì)不同批次蜂膠樣品的測(cè)定比較，規(guī)定蜂膠干燥失重不得過(guò)4.0%、總灰分不得過(guò)8.0%、酸不溶性灰分不得過(guò)6.0%、氧化時(shí)間不得過(guò)22 s。

2.3乙醇浸出物含量按中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅩA浸出物測(cè)定法，對(duì)不同批次的蜂膠樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，合格蜂膠醇浸出物含量在40.50% ～66.60%，不合格蜂膠醇浸出物含量在13.70%～ 39.20%。不合格蜂膠浸出物含量低的原因是多方面的，主要原因?yàn)榉湎灦啵浯螢殡s質(zhì)。中國(guó)藥典2010年版一部蜂膠項(xiàng)下規(guī)定，醇浸出物含量不得少于50%，根據(jù)江西汪氏蜂蜜園有限公司近幾年大生產(chǎn)提取數(shù)據(jù)和本課題組浸出物測(cè)定數(shù)據(jù)表明，合格蜂膠乙醇浸出物大多在40～50%之間，因此，為充分利用資源，規(guī)定蜂膠醇浸出物含量≥40.0%。

2.4蜂膠薄層鑒別取蜂膠樣品100 mg，加甲醇10 ml，超聲提取15 min，作為供試品溶液；另取蜂膠對(duì)照藥材0.1 g（取87號(hào)蜂膠作為對(duì)照），同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述二種溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮∶水∶甲酸（5∶5∶1）為展開(kāi)劑，40℃展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。楊樹(shù)膠157、158、159、自提楊樹(shù)芽膠95和楊樹(shù)膠153～156，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)均不相同，可以判斷為假蜂膠或楊樹(shù)芽膠，其余供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，特征斑點(diǎn)Rf值適中。此方法可以用于鑒別蜂膠真?zhèn)巍?/p>

2.5有毒有害物質(zhì)限量

2.5.1鉛、砷、汞分別按GB5009.12、GB/T5009. 11、GB/T5009.17規(guī)定的方法測(cè)定，結(jié)果顯示，不同批次的樣品重金屬鉛含量測(cè)定結(jié)果相差較大，鉛含量實(shí)測(cè)值在0.75～22.10 mg/kg，砷含量實(shí)測(cè)值在0.13～0.71 mg/kg之間，汞未檢出。根據(jù)實(shí)測(cè)結(jié)果及日本《保健食品原料手冊(cè)》中蜂膠乙醇提取液、蜂膠粉末制品的規(guī)定，Pb≤20 mg/kg，最終標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蜂膠鉛含量≤20 mg/kg，砷含量≤1.0 mg/kg，汞參照無(wú)公害蜂膠標(biāo)準(zhǔn)NY5136-2002制定，含量≤0.3 mg/kg。2.5.2六六六、滴滴涕按GB/T5009.19規(guī)定的方法測(cè)定，結(jié)果不同批次蜂膠中有毒有害物質(zhì)六六六、滴滴涕均未檢出。限度參照無(wú)公害蜂膠標(biāo)準(zhǔn)NY5136-2002制定，規(guī)定六六六、滴滴涕含量均為≤0.05 mg/kg。

2.6蜂膠總黃酮含量測(cè)定方法的研究[8～9]

2.6.1溶液的配制取蜂膠粉末約0.1 g，精密稱(chēng)定，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取喬松素對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)定，置50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.6.2方法學(xué)考察取蜂膠粉末約0.1 g，按照2.6.1項(xiàng)下同法制備供試品溶液，吸取樣品溶液2 ml，以甲醇為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤA）操作，在290 nm處測(cè)定吸光度，并對(duì)精密度、溶液穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率進(jìn)行考察。結(jié)果精密度平均值為0.356，RSD=0.11%；溶液穩(wěn)定性平均值為0.361，RSD=1.19%、重復(fù)性平均值為25.04%（總黃酮含量），RSD=0.84%、平均回收率為99.67%，RSD=0.77%（n=6），說(shuō)明本方法準(zhǔn)確性好。

2.6.3樣品測(cè)定按照2.6.1項(xiàng)下同法配制供試品溶液和對(duì)照品溶液。分別吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液2 ml，以甲醇為空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤA）依法在290 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算。結(jié)果顯示，不同批次合格蜂膠中總黃酮含量在18.63%～47.36%之間，不合格蜂膠中總黃酮含量在6.07～22.59%，楊樹(shù)芽及其提取物中總黃酮含量在1.25～24.15%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，合格蜂膠中只有9號(hào)蜂膠中總黃酮含量為19.66% 和117號(hào)蜂膠中總黃酮含量為18.63%，＜20.0%，其它批次蜂膠中總黃酮含量均＞20.0%，最終規(guī)定蜂膠中總黃酮含量（以喬松素計(jì)）應(yīng)不得少于20.0%。

3　討論

本文利用現(xiàn)代的薄層色譜技術(shù)，確定蜂膠以及蜂膠提取物中的專(zhuān)屬性薄層色譜，方法簡(jiǎn)便易行，為真?zhèn)畏淠z的鑒別提供依據(jù)。通過(guò)多批次蜂膠的性狀、一般性檢查等實(shí)驗(yàn)研究把合格蜂膠定義為：團(tuán)塊狀或不規(guī)則碎塊，呈棕黃色、棕褐色、青綠色或灰褐色，具光澤，10℃以下質(zhì)脆，30℃以上逐漸變軟，氣芳香，無(wú)異味，味微苦，略澀，有辛辣和微麻感。蜂膠干燥失重不得過(guò)4.0%、總灰分不得過(guò)8.0%、酸不溶性灰分不得過(guò)6.0%、氧化時(shí)間不得過(guò)22 s。蜂膠醇浸出物含量≥40.0%，鉛含量≤20 mg/kg，砷含量≤1.0 mg/kg，汞含量≤0.3 mg/kg，六六六、滴滴涕含量均為≤0.05 mg/kg，蜂膠中總黃酮含量（以喬松素計(jì)）應(yīng)不得少于20.0%。利用先進(jìn)的分析手段對(duì)蜂膠進(jìn)行檢測(cè)，建立了系統(tǒng)、全面、科學(xué)的質(zhì)量控制技術(shù)，確保蜂膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，規(guī)范蜂膠的市場(chǎng)秩序。

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Research of the Quality Control for Propolis

WEN Ping1, Dai Xi-xi2, LIU Dan1, YU Liang-zhong1#
(1Jiangxi Traditional Chinese Medicine Institute, Nanchang330046; 2Food and Drug Inspection Institute of Fuzhou City, Fuzhou344000)

Abstract:Objective: To establish the quality control method for propolis. Methods: Checked the characters, loss on drying, total ash, acid insoluble ash, oxidation time, ethanol extract content determination, toxic and harmful substances of the propolis, used TLC to identify the characteristics of propolis, and studied the content determination method of total flavonoids in propolis. Results: The standard limit of each index of propolis was determined. The content determination method of total flavonoids in propolis was established, and by the determination of the content of total flavonoids in the 15 batches of propolis, the range of content was determined. Conclusion: the method is simple, reliable and can be used for the quality control of propolis.

Key words:Propolis; Quality control; Total flavone

*基金項(xiàng)目：江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20141BBG70075）

#通訊作者：余良忠，E-mail：ylz@sohu.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R282.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.02.044

收稿日期：（2015-12-28）