柔嫩艾美耳球蟲裂殖子對侵入細胞凋亡抑制通路的研究

宋麗聰，王黎霞，劉新月，趙晨璐，張建軍，安　健（.北京農學院動物科學技術學院，北京昌平006；.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京房山044）

?

柔嫩艾美耳球蟲裂殖子對侵入細胞凋亡抑制通路的研究

宋麗聰1，王黎霞2，劉新月1，趙晨璐1，張建軍1，安健1
（1.北京農學院動物科學技術學院，北京昌平102206；2.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京房山102442）

摘要：為了研究柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenlla）裂殖子入侵宿主細胞后對凋亡誘導的抑制通路，將純化的裂殖子與牛腎傳代細胞（MDBK細胞）共培養1.5 h。用含6%乙醇的完全培養基誘導細胞凋亡2.5 h，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率。采用標準試劑盒測定Cyto C，Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。流式細胞術結果顯示，入侵裂殖子的細胞在誘導凋亡后其凋亡率為4.57%，而未感染的細胞其凋亡率達到23.69%，二者差異顯著（P＜0.05），誘導凋亡的MDBK細胞早期凋亡率為19.50%，晚期凋亡率為4.19%，而感染裂殖子后誘導凋亡的MDBK細胞其早期凋亡率為3.53%，晚期凋亡率為1.04%，差異顯著（P＜0.05）。結果表明，裂殖子的入侵不但可以抑制細胞凋亡，還可以延緩細胞進入早期凋亡的時間。試劑盒結果表明，裂殖子使Cyto C，Caspase8，Caspase9的活性下降，而Caspase3沒有變化。根據上述結果初步判斷，E. tenlla裂殖子抑制MDBK細胞的凋亡是通過線粒體通路。

關鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；裂殖子；MDBK細胞；細胞凋亡；通路

雞球蟲病是一種由原生動物門寄生蟲引起的疾病，嚴重影響著家禽的飼料轉化率，全球每年因為球蟲病造成的經濟損失約2.4億美元[1]。深入研究球蟲與入侵宿主細胞的相互關系，可以為研制新型抗球蟲疫苗和治療藥物奠定基礎。

研究表明，弓形蟲能通過阻斷不同的凋亡信號級聯放大反應來抑制宿主細胞凋亡，以此延長在宿主細胞內的存活時間，以便于完成生活史[2]。最新的研究表明，弓形蟲等胞內寄生的原蟲可以通過調節NF-KB、Caspase級聯、細胞色素C、P13K-AKB信號通路抑制宿主細胞凋亡[3]。然而，球蟲對宿主細胞凋亡機制的相關研究較少。目前，有研究表明，E.tenella感染可造成宿主細胞膜電位的下降以及線粒體通透性轉換孔（MPTP）的開放。而MPTP開放是E.tenella調節宿主細胞線粒體凋亡通路中的關鍵環節[4]。為了深入研究E.tenella抑制侵入細胞凋亡的機制，我們實驗分離純化E. tenlla裂殖子，使其入侵MDBK細胞，采用6%乙醇作為凋亡誘導劑，采用流式細胞術，標準試劑盒分光光度法檢測裂殖子對細胞線粒體凋亡通路相關因子的變化，初步確定E.tenella抑制MDBK細胞凋亡的通路。

1　材料與方法

1.1E.tenlla BJ4株孢子化卵囊由北京農學院實驗室保存，每3個月用公雞雛復壯，宿主細胞為本實驗室保存的MDBK細胞系。

1.2實驗分組試驗共分4組。A組：未感染球蟲，未誘導凋亡；B組：未感染球蟲，誘導凋亡；C組：感染球蟲，未誘導凋亡；D組：感染球蟲，誘導凋亡，每組3個重復樣品。

1.3裂殖子分離純化及誘導侵入細胞的凋亡

孢子化卵囊感染7日齡無球蟲雛雞，每只雞1× 105卵囊。感染108 h捕殺試驗雞，剪開盲腸壁，在洗脫液中刮下黏膜，勻漿，游離出裂殖子。勻漿通過過濾離心除去盲腸組織塊和大的雜質。加入適量洗脫液重懸，42℃水浴鍋中水浴5 min。將水浴后的裂殖子重懸液加入層析柱中，收集純化后的裂殖子。與傳至第3代的MDBK細胞共培養1.5 h。用6%乙醇誘導細胞凋亡2.5 h。1.4流式細胞術檢測將待測細胞濃度調整為5×105～1×106個/mL。取1 mL細胞，離心收集沉淀。將細胞重懸于200 μL Binding Buffer。加入10 μL PI和10 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min。加入300 μL Binding Buffer，上機檢測。

1.5試劑盒檢測Cyto C的釋放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性按照檢測試劑盒產品說明書，使用比色法和分光光度法檢測Cyto C的釋放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。

1.6統計學分析數據分析采用SPSS17.0軟件進行，用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One Way ANOVA）進行多組間比較分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1裂殖子的純化結果由雞盲腸黏膜分離得到的裂殖子（圖1A），含有大量的細菌，紅細胞及雜質。經DE-52纖維素層析柱純化后，收集到較為純凈的裂殖子（圖1B）。

圖1　裂殖子分離及純化A：分離后未純化的裂殖子；B：純化后的裂殖子

2.2流式細胞術檢測結果未入侵組細胞凋亡率為0.69%（圖2A），入侵組細胞凋亡率為1.34%（圖2C）。誘導細胞凋亡2.5 h后，細胞凋亡率達到23.69%（圖2B）。而裂殖子入侵的細胞，細胞凋亡率僅為4.57%（圖2D），后者細胞凋亡率大約是前者的19.29%。

圖2　流式細胞術檢測MDBK細胞在各種處理方式下的凋亡水平注：左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞和晚期凋亡細胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限顯示早期凋亡細胞，為（FITC＋/PI-）；左上象限顯示機械損傷細胞

2.3Cyto C，Csapase8，Caspase9，Caspase3的檢測結果誘導細胞凋亡后，細胞漿中的Cyto C濃度大于線粒體中的含量（圖3aB），且差異顯著（P＜0.05）。攻蟲后誘導細胞凋亡細胞漿中Cyto C的釋放量也大于線粒體中的含量（圖3aD），且差異顯著（P＜0.05）。但是細胞漿中Cyto C的釋放量小于細胞漿中Cyto C的釋放量（圖3aD），且差異顯著（P＜0.05）。誘導凋亡組Caspase8酶活力高于空白組（圖3b），因此，凋亡誘導有效。而攻蟲誘導凋亡組caspase8酶活力低于誘導凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。誘導凋亡組Caspase9酶活力高于空白組（圖3c），且差異顯著（P＜0.05），因此，凋亡誘導有效。而攻蟲誘導凋亡組caspase9酶活力低于誘導凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。誘導凋亡組Caspase3酶活力高于空白組（圖3d），且差異顯著（P＜0.05），因此，凋亡誘導有效。但攻蟲凋亡組Caspase3酶活力高于誘導凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。

圖3　不同條件下4種凋亡因子的變化注：A：空白組；B：誘導凋亡組；C：攻蟲組；D：攻蟲誘導凋亡組；不同字母代表差異顯著（P＜0.05），相同字母代表差異不顯著

3　結論

本試驗表明，E.tenlla裂殖子可以入侵并抑制MDBK細胞的凋亡，裂殖子可能是通過抑制細胞線粒體凋亡通路中CytoC，caspase8，caspase9的激活達到抑制細胞啟動自我凋亡程序的，而Caspase3是否受到其他蛋白的調控還需要進一步研究。

4　討論

本試驗通過流式細胞術檢測不同處理條件下的細胞凋亡狀況，分析數據可以發現誘導凋亡組，細胞凋亡率達到23.69%（圖2B），而攻蟲凋亡組，細胞凋亡率僅為4.57%（圖2D）。除此之外，誘導凋亡組細胞早期凋亡率為19.50%，晚期凋亡率為4.19%。誘導凋亡組細胞早期凋亡率為3.53%，晚期凋亡率為1.04%。由此可以證明，裂殖子不但可以抑制細胞凋亡，還可以延緩細胞進入早期凋亡的時間，以此延長自身在細胞內的生存時間。

在脊椎動物細胞凋亡過程中，線粒體被認為是處于凋亡調控的中心位置，而其關鍵性因子是細胞色素C。另外，Caspase8被認為是細胞凋亡信號轉導過程中比較上游的一個Caspase。在Fasreceptor和TNFR-1介導的細胞凋亡過程中Caspase8被激活，形成一個P18和P10組成的二聚體，進一步激活下游的Caspase4，Caspase6，Caspase9和Caspase10[5-6]。如圖3a，3b，3c所示，D組均比B組數值低，即裂殖子可以通過抑制Cyto C，Caspase8，Caspase9的激活抑制或延緩細胞凋亡。而圖3d所示，D組Caspase3酶活力高于B組，這可能是因為Caspase3作為直接的凋亡誘導因子處于細胞凋亡調控的最后一環，受到最多的正負調控，如近年研究發現，熱休克蛋白家族和核轉錄因子（NF-κB）家族都具有阻斷宿主細胞凋亡的作用。

目前，弓形蟲與宿主細胞凋亡關系的研究主要集中于JNK通路，曾有報道，堆型艾美耳球蟲存在與痘病毒抑制細胞凋亡相關[7]的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其主要抑制Caspase的活性。NF-κB通路幾乎不依賴Caspase通路，而JNK通路的激活卻和Caspase有很大關系。另外，發現牛艾美耳球蟲入侵細胞可使Fas的表達受c-FLIP的影響[8]，而這個通路與弓形蟲抑制凋亡的通路相關。該通路的受體TNFR1也是NF-κB的重要受體，通過連接TRADD，TRAF2/5，RIP1，激活核因子通路。弓形蟲屬與艾美耳屬在遺傳學上十分相近[9]，因此，我們推測，凋亡過程可能有另外的蛋白參與，或者E.tenlla裂殖子抑制宿主細胞凋亡的通路可能不止一條。

參考文獻：

[1] Mirjam Lang，Michael Kann，Horst Zahner，et al . Inhibition of host cell apoptosis by Eimeria bovis sporozoites[J].Veterinary Parasitology，2009，160：25-33.

[2] Sinai A P，Payne T M，Carmen J C，et al.Mechanisms underlying the manipulation of host apoptotic pathways by Toxoplasma gondii [J].Int J Parasitol，2004，34（3）：381-391.

[3]徐軍.弓形蟲抑制宿主細胞凋亡及其調控機制的研究進展[J].熱帶病與寄生蟲學，2007，5（4）：257-261.

[4]張妍.Eimeria tenella宿主細胞線粒體凋亡通路MPTP開放及其調控機制的研究[D].太谷：山西農業大學，2014.

[5]劉光偉，龔守良.細胞凋亡的線粒體調控機制與電離輻射[J].國外醫學：放射醫學核醫學分冊，2003，7（2）：90-93.

[6] Herr I，Debatin K.Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy[J].Blood，2001.98（9）：2603-2604.

[7] Gurevich R M，Regula K M，Kirshenbaum L A . Serpin protein CrmA suppresses hypoxia-mediated apoptosis of ventricular myocytes[J].Circulation，2001，103（15）：1984-1991.

[8] Lang M，Kann M，Zahner H，et al.Inhibition of host cell apoptosis by Eimeria bovis sporozoites[J] . Vet Parasitol，2009，160（1-2）：25-33.

[9] Martin W，Shirley，Dora A，et al.A Genetic Linkage Map of the Apicomplexan Protozoan Parasite Eimeria tenella[J].Genome Res，2000，（10）：1587-1593.

Thepathway of invaded cells to inhibit apoptosis by Eimeriatenellamerozoites

SONG Li-cong1，WANG Li-xia2，LIU Xin-yue1，ZHAO Chen-lu1，ZHANG Jian-jun1，AN Jian1
（1.College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

Abstract：In order to study the inhibitory pathways of E.tenlla merozoites-invaded host cells after induction of apoptosis，the purified merozoites and MDBK cells were co-cultured for 1.5 h.The apoptosis was induced by complete medium containing 6%ethanol for 2.5 h.Then the apoptosis of MDBK cells was analyzed by flow cytometry .We used kit and spectrophotometry to measure the activity of cytochrome C，Caspase8，and Caspase9.The results of flow cytometry indicated that apoptotic rate was 4.57%in the merozoites group and apoptotic rate was 23.69%in of the group without merozoites，and the difference was significant（P＜0.05）.Early apoptotic rate was 19.50%and late apoptotic rate was 4.19%in the group without merozoites，while early apoptotic rate was 3.53%and late apoptotic rate was 1.04%in the merozoites group.The difference was significiant（P＜0.05）.Merozoites can not only inhibit apoptosis，but also delay cells into early apoptosis.The results also showed that the cyto C，Caspase 8，and Caspase 9 were decreased，while Caspase 3 unchanged.These results suggest that E.tenella merozoites inhibits apoptosis in MDBK cells induced by mitochondrial pathway.

Key words：E.Tenella；Merozoites；MDBK cells；Apoptosis；Pathway

Corresponding author：AN Jian

通訊作者：安健，E-mail：anyh001@bac.edu.cn

作者簡介：宋麗聰（1991-），女，碩士生，研究方向為獸醫寄生蟲與分子生物學，E-mail：13436347439@163.com

基金項目：北京農業職業學院技術研發與示范推廣項目（XFYF-14-09）

收稿日期：2015-03-24

中圖分類號：S852.72+3

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0014- 03