解析新發(fā)突發(fā)傳染病產(chǎn)品應(yīng)急審評(píng)中性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)的基本要求

董勁春

(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京 100044)

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解析新發(fā)突發(fā)傳染病產(chǎn)品應(yīng)急審評(píng)中性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)的基本要求

董勁春

(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心，北京 100044)

近年來(lái)，全球頻發(fā)新發(fā)突發(fā)的傳染病疫情，從2009年的新型甲型H1N1流感病毒暴發(fā)流行，到2013年人感染H7N9禽流感病毒暴發(fā)流行，2014年暴發(fā)的埃博拉病毒出血熱疫情，2015年暴發(fā)的中東呼吸綜合征疫情，2016年暴發(fā)的寨卡病毒疫情，為應(yīng)對(duì)不同時(shí)期境內(nèi)外暴發(fā)的各種傳染病疫情，做好體外診斷試劑應(yīng)急儲(chǔ)備工作，國(guó)家開(kāi)設(shè)了病原體核酸檢測(cè)產(chǎn)品的應(yīng)急審評(píng)。作為國(guó)家藥監(jiān)總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心審評(píng)員，作者下面就應(yīng)急審評(píng)方案中的性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)的基本要求進(jìn)行解析和介紹。

1　性能評(píng)估的基本要求

1.1所有病原體均應(yīng)完成的性能評(píng)價(jià)

1.1.1核酸(RNA)提取/純化性能在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)腞NA提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測(cè)試劑的特性，對(duì)配合使用的RNA提取試劑/方法的提取效率、提取RNA純度等做充分的驗(yàn)證，提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。如果申請(qǐng)的試劑產(chǎn)品無(wú)需進(jìn)行RNA提取/純化，應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料，以明確產(chǎn)品不進(jìn)行RNA的提取/純化也可以達(dá)到很好的檢測(cè)效果，且應(yīng)與需進(jìn)行RNA提取/純化的質(zhì)量較好的試劑產(chǎn)品進(jìn)行充分、詳細(xì)的比對(duì)試驗(yàn)。

1.1.2最低檢測(cè)限

1.1.2.1最低檢測(cè)限的確定將含有病原體目的RNA片段的假病毒顆粒(不同基因型)梯度稀釋于(與適用樣本一致的)適當(dāng)基質(zhì)中，用于進(jìn)行最低檢測(cè)限研究，建議采用質(zhì)粒或其他適宜的方法標(biāo)定假病毒原液的滴度。每個(gè)濃度梯度最少重復(fù)3次檢測(cè)，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計(jì)檢測(cè)限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個(gè)濃度至少重復(fù)20次檢測(cè)，將具有90%～95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測(cè)限[1-3]。提供詳細(xì)的假病毒濃度滴定方法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.1.2.2最低檢測(cè)限的驗(yàn)證采用假病毒在最低檢測(cè)限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)達(dá)到90%～95%陽(yáng)性檢出率。最低檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證均應(yīng)考慮不同病原體的基因型特點(diǎn)和具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同病毒株，原則上應(yīng)包括可檢出的所有基因型以及每個(gè)基因型至少具有代表性的3個(gè)毒株分別進(jìn)行最低檢測(cè)限的確定和驗(yàn)證。以上最低檢測(cè)限評(píng)價(jià)采用的是企業(yè)自行合成的假病毒，應(yīng)詳細(xì)提供假病毒不同基因型、不同毒株的制備方法，明確基因序列。

1.1.3病原體RNA陽(yáng)性檢出能力驗(yàn)證采用病毒檢測(cè)目的基因的體外轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)RNA進(jìn)行檢出能力驗(yàn)證，針對(duì)預(yù)期用途包含的每種病毒型別，均應(yīng)選擇NCBI上已登錄毒株中至少3個(gè)不同病毒株的基因序列分別完成此項(xiàng)驗(yàn)證，每個(gè)病毒株至少設(shè)置三個(gè)濃度水平的RNA樣品，其中包含最低檢測(cè)限附近水平的樣品，建議樣品基質(zhì)與預(yù)期適用樣本類型一致。以試劑盒檢測(cè)上述樣品，考察病毒核酸檢測(cè)試劑的檢出能力，提交相關(guān)研究資料，包括樣本制備方法、滴度確定方法、驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果等。

1.1.4分析特異性

1.1.4.1交叉反應(yīng)用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性，易引起相同或相似的臨床癥狀，采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106cfu/mL或更高，病毒為105pfu/mL或更高。除特別說(shuō)明外，應(yīng)盡量采用滅活的臨床樣本，或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測(cè)樣本類型一致。如病原體培養(yǎng)物不能符合如上要求，企業(yè)應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明理由。交叉反應(yīng)的病原體一般包括各種RNA病毒，如流行性感冒病毒、HIV、丙型肝炎病毒、腸道病毒等；細(xì)菌一般包括傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌等；其他病原體如肺炎支原體、腺病毒、乙型肝炎病毒等；還應(yīng)包括人類基因組DNA。同時(shí)還應(yīng)考慮不同病原體的各自特點(diǎn)，選擇交叉反應(yīng)的病原體種類，以充分反映產(chǎn)品檢測(cè)的特異性。如H7N9病毒應(yīng)選擇新型H1N1流感病毒、H5N1流感病毒、H3N2流感病毒，埃博拉病毒選擇馬爾堡病毒、登革熱病毒、新型布尼亞病毒、漢坦病毒；寨卡病毒選擇登革病毒(4個(gè)型別)、基孔肯雅病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒等；中東呼吸綜合征冠狀病毒選擇腺病毒(如3型、7型)、冠狀病毒229E、冠狀病毒OC43、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒SARS等。申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來(lái)源、種屬/型別信息和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

1.1.4.2干擾試驗(yàn)根據(jù)所采集樣本類型，進(jìn)行干擾物質(zhì)驗(yàn)證。如適用樣本包括全血、血清或血漿，則至少應(yīng)驗(yàn)證血液中存在的膽紅素、三酰甘油、血紅蛋白。如有鼻咽拭子、痰液等還應(yīng)驗(yàn)證血液、鼻分泌物或黏液等的干擾，同時(shí)還應(yīng)包括患者可能使用的抗病毒藥物等的干擾情況。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。申請(qǐng)人應(yīng)至少采用兩個(gè)濃度水平的病毒(假病毒)稀釋液進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究，其中應(yīng)包括最低檢測(cè)限附近水平。

1.1.5精密度測(cè)量精密度的試驗(yàn)方法可以參考相關(guān)的CLSI-EP文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。精密度評(píng)價(jià)中應(yīng)考慮檢測(cè)試劑本身以及其他要素的可能造成的精密度波動(dòng)，包括PCR分析儀、操作者、地點(diǎn)等要素；應(yīng)設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；用于精密度評(píng)價(jià)的質(zhì)控品應(yīng)至少包括3個(gè)水平(陰性、臨界陽(yáng)性和中、強(qiáng)陽(yáng)性)，可采用包含目的RNA的假病毒，基質(zhì)應(yīng)與適用樣本類型一致[3]。

1.2需采用真實(shí)病原體完成的性能評(píng)估對(duì)于埃博拉出血熱這樣的高病死率傳染病，病毒實(shí)驗(yàn)操作要求非常高，歸為生物安全第4級(jí)病毒，我國(guó)當(dāng)時(shí)并沒(méi)有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以達(dá)到病毒培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)的要求，因此實(shí)際上無(wú)法完成真實(shí)病毒株的性能驗(yàn)證，所以只能采用企業(yè)自行合成的假病毒進(jìn)行所有性能的驗(yàn)證[4]。對(duì)于H7N9流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒，由于國(guó)內(nèi)病例較多，企業(yè)可以獲得真實(shí)病毒株，因此需采用病毒株自行進(jìn)行性能驗(yàn)證，也可委托其他有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)代為完成性能評(píng)價(jià)。而對(duì)于中東呼吸綜合征冠狀病毒[5]、寨卡病毒[6]，由于國(guó)內(nèi)病例較少，企業(yè)無(wú)法獲得病毒株，但是中國(guó)疾病預(yù)防控制中心通過(guò)病毒分離培養(yǎng)或向境外購(gòu)買的方式可以獲得病毒株。對(duì)于此類病毒，企業(yè)需委托中國(guó)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行產(chǎn)品部分性能的驗(yàn)證。對(duì)于病毒株至少應(yīng)驗(yàn)證以下性能。

1.2.1最低檢出限的驗(yàn)證應(yīng)對(duì)不同的型別或是境內(nèi)主要流行的型別分別進(jìn)行最低檢測(cè)限的驗(yàn)證，應(yīng)明確病毒株的確認(rèn)方法、病毒滴度的確定方法，有條件時(shí)應(yīng)對(duì)不同地域流行的主要毒株也進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證。與國(guó)家疾病預(yù)防控制中心公認(rèn)的檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)時(shí)，企業(yè)產(chǎn)品的最低檢測(cè)限應(yīng)不低于國(guó)家疾病預(yù)防控制中心公認(rèn)檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限。

1.2.2重復(fù)性采用病毒株進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)對(duì)高、低兩個(gè)濃度的樣本分別進(jìn)行驗(yàn)證，其中一個(gè)濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。

1.2.3交叉反應(yīng)對(duì)于一些較難獲得的交叉反應(yīng)病原體也可委托國(guó)家疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行產(chǎn)品性能的驗(yàn)證，如基孔肯雅病毒、黃熱病毒、登革病毒等。

2　臨床試驗(yàn)要求

2.1總樣本量要求應(yīng)急產(chǎn)品都是全新病原體導(dǎo)致疾病的暴發(fā)和流行，因此臨床的總樣本數(shù)均應(yīng)大于1 000例，申請(qǐng)人應(yīng)按照《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求在相應(yīng)的臨床環(huán)境中對(duì)試劑的臨床性能進(jìn)行系統(tǒng)性研究[2]。如檢測(cè)試劑適用于不同的樣本類型，原則上不同的樣本類型的病例數(shù)之和大于1 000例即可，但每種樣本類型的病例數(shù)不能過(guò)少，病例數(shù)須差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2陽(yáng)性樣本量要求

2.2.1對(duì)于境內(nèi)大范圍流行的疾病，陽(yáng)性病例數(shù)不得少于300例，如新型甲型H1N1流感病毒。

2.2.2如在境內(nèi)屬于散發(fā)病例，但病例數(shù)相對(duì)較多，則至少完成境內(nèi)陽(yáng)性病例數(shù)的50%以上，如人感染H7N9禽流感病毒。

2.2.3如在境內(nèi)陽(yáng)性病例數(shù)極少，也應(yīng)至少完成境內(nèi)陽(yáng)性病例數(shù)的50%以上，同時(shí)應(yīng)采用假病毒與臨床樣本混合的方式進(jìn)行臨床試驗(yàn)，陽(yáng)性例數(shù)應(yīng)大于200例，如中東呼吸綜合征病毒。

2.2.4如境內(nèi)沒(méi)有陽(yáng)性病例，應(yīng)采用假病毒與臨床樣本混合的方式進(jìn)行臨床試驗(yàn)，陽(yáng)性例數(shù)應(yīng)大于200例。同時(shí)如果有條件，可以采用去疫區(qū)(境外)檢測(cè)的方式進(jìn)行臨床試驗(yàn)，陽(yáng)性病例數(shù)也應(yīng)大于200例，如埃博拉病毒。

2.2.5如在境內(nèi)陽(yáng)性病例數(shù)極少，但滅活的病毒株可以獲得，病毒的致病性也較低，除必須至少完成境內(nèi)陽(yáng)性病例數(shù)的50%病例外，還應(yīng)采用滅活的病毒株與臨床樣本混合的方式進(jìn)行臨床試驗(yàn)，陽(yáng)性例數(shù)應(yīng)大于200例，如寨卡病毒。

2.3陰性樣本要求對(duì)特異性驗(yàn)證所需的陰性樣本，應(yīng)當(dāng)選擇易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物感染的患者。一般建議考慮有呼吸道疾病、發(fā)熱、腹瀉、出血熱等癥狀的患者，所有樣本均應(yīng)為獨(dú)立的臨床樣本。臨床數(shù)據(jù)匯總表格中應(yīng)明確臨床診斷結(jié)果，包括感染病原體名稱。以上所有樣本編盲后進(jìn)行RNA提取和病毒RNA檢測(cè)，以交叉四格表的形式總結(jié)檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如四格表卡方檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)。根據(jù)以上臨床研究結(jié)果，對(duì)檢測(cè)試劑的臨床性能進(jìn)行預(yù)評(píng)價(jià)。

總之，由于每種疫情暴發(fā)都有自己的特點(diǎn)，如不同的流行傳播方式、不同的病原體特點(diǎn)、不同的致病性等。因此應(yīng)根據(jù)不同病原體的特點(diǎn)，分別制定了不同病原體性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)的研究及評(píng)價(jià)方法，以更科學(xué)、更充分的評(píng)價(jià)核酸檢測(cè)試劑的基本性能，使其能夠適于臨床使用，最大程度的減少漏檢率和假陽(yáng)性率。

[1]體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法．國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)[Z]，2014．

[2]李嚴(yán)亮.體外診斷試劑質(zhì)量體系中企業(yè)參考品的管理研究[J].科技資訊,2013，12:176.

[3]Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens.Center for devices and radiological health[Z],2005.

[4]Ebola Z,Rrt-Pcr(taqman?)assay On Abi?7500 Fast Dx LC,JBAIDS.The naval medical research center for the U[Z],2014.

[5]Corman VM,Olschlager S,Wendtner CM.Performance and clinical validation of the RealStar MERS-CoV Kit for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus RNA[J].J Clin Virol,2014,60(2):168-171.

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董勁春(1974-)，副主任技師，碩士，主要從事體外診斷產(chǎn)品的技術(shù)審評(píng)。

·短篇及病例報(bào)道·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.049

R373.1

C

1671-8348(2016)26-3741-02

2016-03-18

2016-06-06)