基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在真菌快速鑒定中的應用

王　歡，曲　芬

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·導向與述評·

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在真菌快速鑒定中的應用

王歡，曲芬

［摘要］真菌是廣泛分布于自然界的真核生物，對人類具有致病性的約300種。不同種真菌的生長特性、臨床特點及耐藥性不同。真菌生長緩慢，傳統的培養鑒定方法所需時間較長，且日益多樣化的真菌，使鑒定難度不斷增加，這些均限制了臨床的早期診斷和針對性治療。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是一種新興的診斷技術，可以通過直接檢測生物標志物（蛋白）來鑒定病毒、細菌、分枝桿菌等，具有操作簡便、快速、準確率高、成本低的特點。本文對MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應用進行綜述，發現其對酵母樣真菌的正確鑒定率可達到94％以上，絲狀真菌正確鑒定率也可達到89％，可滿足臨床實驗室鑒定真菌的需求。

［關鍵詞］光譜法，質量，基質輔助激光解吸電離；真菌；感染

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.002

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，器官移植和導管技術的開展，以及腫瘤患者和接受免疫抑制藥物治療的患者逐年增多，真菌（如假絲酵母菌屬、隱球菌屬和曲霉菌屬等）感染成為危及這類患者生命的主要因素。全球每年約有7280萬假絲酵母菌感染病例，在美國假絲酵母菌屬是引起醫源性血流感染的第4大常見病原菌；其中白假絲酵母菌成為最重要的致病真菌［1］。目前，已知有100余種酵母樣真菌確定為人類病原體，并在幾乎所有的人身體部位被分離出來。真菌的特點是培養生長緩慢，實驗室常規鑒定和藥物敏感性（藥敏）實驗時間長，對臨床的早期診斷和治療造成困難，導致真菌感染的病死率升高［2］。早期、快速、準確地診斷真菌感染是臨床及時救治真菌感染的關鍵［3］。然而，日益多樣化的真菌使鑒定真菌病原體難度不斷增加，常規鑒定方法的鑒定能力已顯不足，尤其對不常見的真菌，結果有時還不確定［1］。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）是近年快速發展起來的一種新型軟電離生物質譜，具有強大的鑒定能力。自2009年開始用于真菌的鑒定［1］，具有操作簡便、鑒定迅速、準確率高和成本低的特點，可替代微生物實驗室對真菌的常規檢測方法［4-8］。本文就MALDI-TOF MS在真菌鑒定和真菌藥敏檢測方面的應用進行綜述。

1　MALDI-TOF MS的檢測原理

MALDI-TOF MS主要由2部分組成——基質輔助激光解吸電離離子源（matrix-assisted laser desorption ionization， MALDI）和飛行時間質量分析器（time of flight， TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，使生物分子電離的過程。因此，它是一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同，測定離子的質荷比（M/Z）。不同菌的蛋白表達不同，通過MALDI-TOF MS得到的蛋白質圖譜也不同，將待測菌的蛋白質圖譜與數據庫中的進行比對，根據圖譜的匹配度，得出鑒定結果和相應的鑒定分值，分值越高，匹配度越好，結果越可信。

2　MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應用

2.1MALDI-TOF MS在酵母樣真菌鑒定中的應用對酵母樣真菌臨床上常用的鑒定方法有科瑪嘉顯色培養法以及VITEK 2和API ID 32C鑒定法。這些方法對常見真菌（白假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌）的鑒定正確率可以達到92％～96％［9］，但鑒定種類有限，耗時達24～72 h，成本高，對某些酵母菌鑒定準確度差。例如，這些方法不能將近平滑假絲酵母菌與擬平滑假絲酵母菌和似平滑假絲酵母菌區分開，同樣不能把光滑假絲酵母菌與Candida bracarensis和Candida nivariensis區分開［10］。國外的快速膠乳凝集測定，雖然快速、精確，但也只能鑒定若干種，而且步驟復雜、價格昂貴［11］。分子生物學測序是鑒定的“金標準”［9，12-13］，但實驗對人員、環境和設備要求高，鑒定周期長，價格高，并且存在環境污染的高風險，不能用作實驗室的常規檢測［13］。

2009年Marklein等［1］第1次用MALDI-TOF MS對250株假絲酵母菌進行了鑒定研究。采用Microflex質譜儀（Bruker Daltonics 公司，德國）和FlexControl 3.0軟件，單株菌的鑒定只需10 min，3 h可以完成96株菌的檢測。分別采用MALDI Biotyper軟件的1.1和2.0版本同時進行分析，得到了96％的鑒定正確率，共正確鑒定14種酵母菌（白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、乳酒假絲酵母菌、葡萄牙假絲酵母菌、挪威假絲酵母菌、皺褶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌、解脂假絲酵母菌、西弗假絲酵母菌、菌膜假絲酵母菌和季也蒙假絲酵母菌）。由于數據庫中沒有挪威假絲酵母菌、皺褶假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌和西弗假絲酵母菌相應的圖譜，這幾種菌沒有被正確鑒定。2010年Stevenson等［14］報道MALDI Biotyper軟件的2.0.4版本對所研究的194株假絲酵母菌鑒定正確率達99％，且這些菌種圖譜都囊括在數據庫中。

2011年Seyfarth等［15］將采用MALDI-TOF MS 和API ID 32C對酵母樣真菌鑒定的結果進行比對，并用分子生物學測序方法進行驗證，結果顯示MALDI-TOF MS的鑒定正確率為94.0％，API ID 32C的鑒定正確率為84.3％。采用MALDI-TOF MS鑒定克柔假絲酵母菌全部正確，而API ID 32C則把克柔假絲酵母菌鑒定為挪威假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等其他假絲酵母菌。Marklein等［1］也曾對250余株酵母樣真菌做了同樣的比對實驗，結果顯示API ID 32C的鑒定正確率為93.6％，MALDITOF MS的鑒定正確率達到98.0％，與Seyfarth等［15］的結果略有差異。Yaman等［16］采用MALDI-TOF MS和VITEK 2對281株從血培養中分離出的酵母樣真菌進行鑒定，經比對二者94％的結果一致，對不一致的結果進行了分子生物學鑒定，其結果與MALDI-TOF MS鑒定結果相同，MALDI-TOF MS對菌屬的鑒定正確率達到了100％。國內也有類似的研究，靳穎等［17］采用同樣的比對方法對150株酵母樣真菌進行鑒定，MALDI-TOF MS鑒定正確率在屬水平上為100％，種水平上為94％，與國外報道一致。

Westblade等［18］采取直接將菌株點靶，在上面覆蓋甲酸的方法，對852株菌共31個種進行評價，其中包括20種626株假絲酵母菌，35株新型隱球菌和191株其他酵母樣真菌，比對“金標準”采用26S rRNA序列分析。結果顯示823株（96.6％）在屬的水平鑒定正確，819株（96.1％）在種的水平鑒定正確。24株（2.8％）沒有查明，5株（0.6％）被錯誤鑒定。其中1株白假絲酵母菌被錯誤鑒定為都柏林假絲酵母菌，1株近平滑假絲酵母菌被錯誤鑒定為菌膜假絲酵母。研究者還對不同種的假絲酵母菌的鑒定正確率進行了統計，白假絲酵母菌為98.3％，都柏林假絲酵母菌為100％，無名假絲酵母菌為96.6％，光滑假絲酵母菌為100％，季也蒙假絲酵母菌為97.2％，希木龍假絲酵母菌為100％，平常假絲酵母菌為100％，中間假絲酵母菌為100％，乳酒假絲酵母菌為100％，克柔假絲酵母菌為100％，郎比可假絲酵母菌為100％，解脂假絲酵母菌為100％，葡萄牙假絲酵母菌為87.9％，挪威假絲酵母菌為96.7％，近平滑假絲酵母菌為98.6％，菌膜假絲酵母菌為100％，皺褶假絲酵母菌為100％，熱帶假絲酵母菌為90.7％，產朊假絲酵母菌為100％，誕沫假絲酵母菌為100％。其他酵母樣真菌鑒定正確率分別為新型隱球菌100％，奧默柯達菌90.9％，糠秕馬拉色菌85.7％，粘質紅酵母菌100％，阿氏絲孢酵母菌93.8％，粘性絲孢酵母菌88.9％。

近年來研究發現近平滑假絲酵母菌通過基因分型可以分為近平滑假絲酵母菌、似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母菌3個組，3者之間對藥物的敏感性存在差異，特別是對棘白菌素類抗真菌藥［19-20］。這表明物種鑒定可能對治療產生影響。Quiles-Melero等［21］對77株臨床分離的近平滑假絲酵母菌復合群進行了MALDI-TOF MS分型，并用分子生物學方法進行驗證，符合率為100％。這表明通過MALDI-TOF MS可以對近平滑假絲酵母菌復合群進行準確的種內分型，更好地指導臨床用藥。

2.2MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定中的應用絲狀真菌感染常侵犯免疫功能低下的患者，特別是進行化療、激素治療或造血干細胞移植中性粒細胞減少的患者，其他有感染風險的是糖尿病、惡性血液病、人器官移植或大面積燒傷的患者以及HIV感染者［22-23］。臨床實驗室對絲狀真菌一直是依靠培養后鏡下觀察其形態特點和產孢方式，并結合菌落生長的形態和顏色等鑒定，這需要檢驗人員有豐富的絲狀真菌鑒定經驗。絲狀真菌培養通常需要72 h以上才能呈現較明顯的菌落特點，如果鏡下不能確定，再經過測序鑒定，往往要耗費7 d左右的時間，患者往往已經錯過了最佳治療時間。

國外有實驗室嘗試用MALDI-TOF MS對絲狀真菌進行鑒定。Ranque等［9］選取了58種共625株絲狀真菌，應用傳統的方法和MALDI-TOF MS同時鑒定，并用測序方法進行確認，鑒定正確率分別為80％和89％。對非曲霉菌類的絲狀真菌，MALDI-TOF MS的鑒定能力較傳統方法提高了31％～61％。研究表明，MALDI-TOF MS對曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉和毛霉目這幾種絲狀真菌鑒定效果較好。也有文獻報道，MALDI-TOF MS對曲霉菌的鑒定正確率可以達到98.4％［24］。

Hettick等［25-26］分別選取了12種曲霉菌和12種青霉菌進行研究，屬的鑒定正確率均達到了100％，種的鑒定正確率為95％。也有研究者使用MALDI-TOF MS成功識別了6種青霉屬菌株［27］。

國內鮮有應用MALDI-TOF MS對絲狀真菌鑒定的報道。絲狀真菌因其蛋白提取困難，目前沒有規范的提取操作規程，且MALDI-TOF MS的數據庫中相關圖譜有限，所以其對絲狀真菌的鑒定能力與對酵母樣真菌的鑒定相比稍顯遜色，還須不斷擴充新的圖譜數據庫，優化統一操作，以增強鑒定絲狀真菌的能力。

2.3MALDI-TOF MS對真菌藥敏檢測的研究真菌感染的增加使其耐藥性呈現上升趨勢，尤其是酵母樣真菌對治療中常用到的氟康唑的耐藥率達到19.66％［28］。Marinach等［29］用MALDI-TOF MS檢測白假絲酵母菌對氟康唑的敏感性。將氟康唑的藥物濃度連續稀釋，從128 mg/ml到0.125 mg/ml，并將不同濃度的氟康唑和白假絲酵母菌進行15 h的混合培養，經過處理萃取后，通過MALDI-TOF MS分析上清液得到圖譜，圖譜發生改變的最低藥物濃度稱為最小剖面變化濃度。將最小剖面變化濃度與臨床實驗室標準化協會的最小抑菌濃度值進行比對，發現1個稀釋度內的結果一致率為94％。MALDI-TOF MS對真菌藥敏檢測的研究還在起步階段，將來有可能替代現有的藥敏檢測方法，得到快速準確的藥敏結果。

3　MALDI-TOF MS在真菌鑒定中的應用前景

MALDI-TOF MS檢測真菌穩定性較強、重復性好、操作簡便快速、成本低、鑒定種類多且結果準確，是臨床實驗室鑒定真菌的一種快速、可靠的方法［16］，大大縮短了臨床微生物實驗室檢測真菌的報告時間。對于絲狀真菌的蛋白提取方法，目前尚無統一的操作規范，所以MALDI-TOF MS對絲狀真菌的鑒定能力還有待進一步研究。應用中發現，MALDI-TOF MS的絲狀真菌數據庫中，還有很多菌種的圖譜沒有包含，這也為實驗室提供了更大的拓展空間，實驗室可以根據自身的特點，建立個性化的數據庫，提高檢測效率和準確性［30］。MALDITOF MS以其諸多的優點，逐漸替代微生物實驗室鑒定真菌的傳統方法。MALDI-TOF MS檢測真菌藥敏的研究，將為準確、合理地應用抗真菌藥物治療臨床真菌感染提供快速、有力的依據［31］。

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（2015-11-04收稿 2016-01-21修回）

（責任編委 李 軍 本文編輯 王 姝）

［文獻標志碼］［中國圖書資料分類號］ R379 A

［文章編號］1007-8134（2016）03-0129-04

*Corresponding author， E-mail： qf302@163.com

［基金項目］首都衛生發展科研專項基金（2011-4001-09）

［作者單位］100039 北京，解放軍第三〇二醫院臨床檢驗醫學中心（王歡、曲芬）

［通訊作者］曲芬，E-mail∶ qf302@163.com

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification of fungi

WANG Huan， QU Fen*
Clinical Laboratory Center， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Fungi are widely distributed in nature， and about 300 species of fungi are pathogenic to humans with different growth characteristics， clinical features and drug resistance. As fungi are slowly growing microorganisms， the culture and identification of fungi by conventional methods are time-consuming. In addition， the increasing diversity of fungal pathogens makes the identification more difficult. All these restrict the early diagnosis and targeted therapies. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） is an emerging diagnostic technique in recent years， which can identify viruses， bacteria， mycobacteria and so on through direct detection of biomarkers （proteins）. It is a simple and fast diagnostic method with high accuracy and low cost. This review focuses on the identification of fungi by MALDI-TOF MS. Studies have shown that correct identification by MALDI-TOF MS is observed in more than 94％ of yeast-like fungi， and 89％ of filamentous fungi. Therefore， MALDI-TOF MS proves to meet the demand for the identification of fungi in clinical laboratory.

［Key words］spectrometry， mass， matrix-assisted laser desorption-ionization； fungi； infection