CD4/CD45雙色單平臺法檢測HIV感染者CD4+T淋巴細胞研究進展

許亞寧，張　輝，肖　瑤

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·專題綜述·

CD4/CD45雙色單平臺法檢測HIV感染者CD4+T淋巴細胞研究進展

許亞寧，張輝，肖瑤

［摘要］CD4+T淋巴細胞計數是評價AIDS疾病進展和抗病毒治療效果的重要指標。本文介紹了流式細胞儀CD4+T淋巴細胞計數方法的發展歷史。將CD4/CD45雙色單平臺法的準確性、可靠性和經濟性與其他方法進行了比較。表明該法簡便、廉價且實用性強。同時介紹了當前適用于CD4/CD45雙色單平臺法的幾款流式細胞儀的機型特點。

［關鍵詞］HIV；CD4+T淋巴細胞計數；抗原，CD45；流式細胞術

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.014

HIV感染引起的AIDS是世界性公共健康問題［1］。根據美國疾病預防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention， CDC）2015年調查統計，世界約有3690萬人攜帶HIV，累計約有7600萬人感染HIV，3900萬人死于AIDS，僅2014年死亡人數就超過120萬人［2］。HIV感染的典型特征是CD4+T淋巴細胞數量減少，T淋巴細胞功能受損和機體免疫功能缺陷。2014年5月更新的《HIV-1感染的成年人和青少年的抗逆轉錄病毒藥物使用指南》中將CD4+T淋巴細胞絕對計數作為AIDS檢測的重要標準。一直以來，研究人員使用傳統的雙平臺三色以上熒光抗體染色法進行CD4+T淋巴細胞絕對計數，但是這些方法檢測費用昂貴，對實驗室設備、人員和檢測樣本要求較高，不適宜進行高通量的HIV檢測。隨著科技的發展，新興的CD4/CD45雙色流式細胞儀單平臺法檢測CD4+T淋巴細胞不僅操作簡單，價格低廉，而且準確性高，能夠作為標準方法廣泛推廣。

1　CD4+T淋巴細胞計數的發展

CD4+T淋巴細胞計數始于20世紀90年代，采用雙平臺法，使用血液分析儀檢測淋巴細胞總數，使用流式細胞儀CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗體檢測CD4+T淋巴細胞所占淋巴細胞百分比，由此計算出CD4+T淋巴細胞數［3］。1996年O’Gorman和Gelman［4］提出使用流式細胞儀單平臺法進行CD4+T淋巴細胞絕對計數。單平臺法是指通過一臺流式細胞儀直接檢測淋巴細胞亞群絕對數量，計數原理包括直接體積計數、內參照微球計數、毛細管計數、阻抗法計數和推進器容積計數等，但由于技術手段問題，淋巴細胞絕對計數的準確性和重復性略顯不足。鑒于各種方法的不統一性，1997年美國CDC更新CD4+T淋巴細胞計數指導方針，推薦用雙平臺法進行CD4+T淋巴細胞計數［5］。此法不足之處在于：①不同操作者和不同操作方式得出不同的淋巴細胞計數結果；②無法進行兩臺設備間的質控和室間質控；③血液分析儀中的淋巴細胞定義有異于流式細胞儀中的淋巴細胞，造成系統差異；④多種抗體和消耗品的使用導致成本偏高。2002年Glencross等［6］提出CD4/CD45雙色法：使用CD45輔助白細胞設門法，基于白細胞而不是單純的淋巴細胞進行設門，由血液分析儀的白細胞絕對計數和流式細胞儀的CD4+T淋巴細胞相對計數計算出CD4+T淋巴細胞數量。隨后，加拿大CDC于2003年頒布了單平臺CD45輔助白細胞設門法的CD4+T淋巴細胞絕對計數指導方針，對雙色單平臺法進行詳述和推薦［7］。至此，CD4/CD45雙色單平臺法測定CD4+T淋巴細胞絕對計數趨于成熟穩定。

CD4/CD45雙色單平臺法通過設門的方法測定CD4+T淋巴細胞絕對計數和相對計數。首先，在CD45/SSC（side scatter，側向角散射）散點圖中調整SSC和CD45（圖1），使所有白細胞群均可見，并圈定白細胞群（R3），其次，根據白細胞群（R3）設門再設定CD4/SSC散點圖，通過設門將表達CD4的陽性淋巴細胞亞群（R1）和CD4陰性淋巴細胞亞群（R2）進行區分，CD4弱表達的單核細胞干擾可通過其在SSC坐標的位置進行區分，并通過修改SSC坐標進行調整。CD4+T淋巴細胞絕對計數由R1得出，CD4細胞相對計數為CD4+/CD45+比值，也叫做CD4+T淋巴細胞相對計數百分率［8］。

圖1　CD4/CD45雙色單平臺法CD4+ T淋巴細胞計數Figure 1 CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

2　單平臺雙色和多色免疫分型的比較

許多指導手冊提出，使用流式細胞儀對HIV感染者進行CD4+T淋巴細胞計數必須加強質量控制，增強數據可靠性［9］。策略包括增加CD3抗體的使用，同時具有CD4和CD3雙陽性的淋巴細胞，才被認為是有指導意義的輔助性T淋巴細胞。美國國家過敏和傳染病研究所AIDS分所建議使用多色抗體組合的方法，例如使用CD3/CD4確定T淋巴細胞/輔助性T淋巴細胞群；使用CD3/CD8確定T淋巴細胞/抑制性T淋巴細胞群。在多色抗體組合方案中對CD3陽性細胞的重復性有要求，重復結果差異應≤3％，如果＞3％，說明樣本的管間變異較大，建議重新檢測此樣本。一般來講，成年人外周血中CD4+CD3+T淋巴細胞和CD8+CD3+T淋巴細胞百分比的總和應該等于CD3+T淋巴細胞的百分比，變化范圍為5％～10％，如果超出此變化范圍，須要考慮其他因素，例如樣本中可能大量存在異常T淋巴細胞亞群。

CD4/CD45雙色法建立之初，關于HIV感染者中CD4+T淋巴細胞絕對計數采用雙色法或多色法分析具有爭議，CD4/CD45法的準確性、重復性成為研究內容。Pattanapanyasat等［10］對611例HIV感染者樣本使用CD4/CD45雙色和CD3/CD4 /CD45三色法進行CD4+T淋巴細胞計數，2種方法的CD4+T淋巴細胞相對計數差異為0.03％。與三色法相比，雙色法檢測成本由12美元降低至2.5美元。Sippy-Chatrani 等［11］使用150例HIV感染者血液樣本比較CD4/CD45雙色法與CD3/CD4/CD8/CD45四色法CD4+T淋巴細胞絕對計數。結果表明，2種方法測量所得CD4+T淋巴細胞絕對計數和相對計數具有高度一致性（r2=0.95、0.98），無顯著偏差，測試成本由25美元節約至8美元。由于操作簡便，對研究人員技術要求低，結果準確，可重復性高以及成本低廉，CD4/CD45雙色法不再局限于資源緊張或者疾病的高發地區，逐漸引起廣泛的關注。2008年Denny等［12］使用不同品牌流式細胞儀對99 例HIV感染者樣本進行CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測，用以評估CD4/CD45雙色法與四色法的精確性。研究表明，CD4/CD45雙色法數據一致性和精確性均高于傳統的四色法。推薦所有臨床和科研機構，特別是進行大批量樣本處理的機構，使用此方法提高實驗數據的可靠性和可重復性。與此同時，我國學者也對CD4/CD45法進行評估，旨在評價樣本采集后不同放置時間是否影響檢測結果的準確性和重復性。結果表明CD4/CD45法簡便準確、重復性好、誤差小，對于陳舊樣本（采集后不超過6 d）的分析有獨到的優勢［13］。CD4/CD45雙色法與多色法在CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測方面具有較高的一致性，而且大大降低測試成本，尤其適合我國國情。

3　CD4+T淋巴細胞計數單平臺法與雙平臺法的比較

與傳統的雙平臺CD4+T淋巴細胞計數法相比，CD4/CD45單平臺法自創建起就備受爭議。1999 年Barnett等［14］使用三種單平臺系統（FlowCount/ Beckman Coulter、 TruCount/Becton Dickinson、CytoronAbsolute/Ortho Clinical Diagnostics）進行CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測，并與CD4/CD45雙平臺法進行比較。對于固定血液樣本，單平臺法的相關性優于雙平臺法（CV值分別為13.7％和23.4％），出于對實驗重復性的考慮，作者建議使用單平臺法。文章指出，使用計數微球進行體積測定的操作中，不同的操作手法會造成較大差異性，某些材質的計數微球也會由于形成多聚體造成結果偏差。2002年，Glencross等［15］使用CD4/CD45雙色雙平臺和單平臺法進行CD4+T淋巴細胞計數檢測，結果發現，2種方法的CD4+T淋巴細胞計數具有良好的一致性（r=0.94），單平臺體積法和微球法不僅具有高度準確性，而且可以進行內部控制和外部控制，能夠作為標準的CD4+T淋巴細胞計數檢測方法進行使用。同年，Janossy 等［16］使用單平臺體積法和微球法對600例樣本進行CD4+T淋巴細胞絕對計數。與雙平臺法比，2種單平臺法均保證了結果的準確度，并可降低93％的試劑成本。2006年，Karcher等［17］使用兩種單平臺法［Cyto-Spheres /Beckman Coulter和 CyFlow Counter/Partec （CD4/CD45）］進行CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測，并與雙平臺雙色法（FACScan/ Becton Dickinson）進行比較。結果證明，使用絕對體積真實計數的CyFlow Counter避免了CytoSpheres使用計數微球造成的誤差，在準確度和相關性上，CyFlow Counter均比CytoSpheres效果好（r = 0.929、0.725）。此外，CyFlow Counter由于價格低廉（1.75～2.00歐元/樣本），操作簡單，結果快速（10樣本/h），尤為推薦在經濟不發達地區使用。隨著科技發展，單平臺法以其簡便的操作，高度的準確性和一致性，已經逐漸替代雙平臺法成為主要的CD4+T淋巴細胞計數檢測方法。

4　目前采用單平臺法CD4+T淋巴細胞絕對計數常用機型

隨著科技的發展，許多商業化的單平臺技術被大力研發和廣泛使用，表1例舉了一些常見的可使用CD4/CD45法的流式細胞儀品牌機型。以下選取部分代表性機型進行討論。 CyFlow Counter 和CyFlow miniPOC（Point of Care）是由德國Partec公司生產的桌面式流式細胞儀，配備有532 nm的綠色固態激光，3個光學信號通道，可使用CD4/ CD45雙色法進行CD4+T淋巴細胞計數［18］。系統使用機械方法進行體積測量，省去微球的使用直接計算進樣體積，減少任何與微球濃度變化相關的誤差。由于系統精準性較高，對操作者技術要求較低，適用于偏遠地區或者患者分散地區，每日最大檢測量為400個樣本。FACSCalibur是Becton Dickinson為常規免疫表型分析所研制的一款流式細胞儀，儀器最多可配備488 nm藍色和635 nm紅色氣態激光，可使用CD4/CD45設門法和微球計數法對CD4+T淋巴細胞絕對計數［19］。樣本制備至檢測需要1 h左右，對實驗技術要求低，適用于每日樣本量小于50的實驗室。Cytomics FC 500流式細胞儀是Beckman Coulter研制的產品，配備488 nm藍色激光器，可檢測5種熒光通道［20］。儀器可使用CD4/CD45設門法進行CD4+T淋巴細胞絕對計數，通過微球法進行體積定量。樣本檢測需100 μl全血，樣本準備需1 h左右。EPICS XL流式細胞儀是Beckman Coulter的產品，最多檢測四色熒光，配合使用計數微球和相關抗體可檢測CD4+T淋巴細胞絕對計數。BriCyte E6系統是邁瑞公司研發的中國第一款流式細胞儀，其配備488 nm藍色激光和638 nm紅色激光，可檢測6種熒光通道。使用計數微球和CD4/CD45設門法進行CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測。由于體積較大，不便于搬運攜行，適合高通量樣本檢測的醫療科研機構，并須配備專業操作人員。

5　展　　望

我國自1985年發現首例AIDS患者以來，HIV/ AIDS在我國已經歷傳入期和局部流行期，進入了快速增長期，并且正由高危人群向一般人群傳播，HIV未能確診及晚期診斷是目前我國存在的典型問題。診斷時，外周血CD4+T淋巴細胞計數是預測短期和長期病死率的一項強有力的指標，目前由于我國大部分病例處于農村和邊遠地區，離體24 h內的新鮮標本較難得到［21-22］，為CD4+T淋巴細胞檢測提出挑戰。CD4/CD45法采用基于白細胞的設門方案，利用CD4、CD45 和側向散射光3個參數對細胞進行細胞亞群免疫表型分析， 避免了傳統方法中根據淋巴細胞絕對計數和CD4+T淋巴細胞相對計數確定CD4+T淋巴細胞數量時淋巴細胞這一關鍵因素不易質控的棘手問題，同時提高了長距離運輸及長時間放置樣本檢測結果的可靠性。因此，CD4/CD45法對HIV感染人群， 尤其是農村和邊遠地區HIV感染人群，在疾病病程監控、治療以及療效評價等方面具有較高的應用價值。

表1　CD4/CD45單平臺CD4+ T淋巴細胞計數不同系統Table 1 Different brands for flow cytometry using single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

綜上所述，CD4/CD45單平臺法檢測HIV感染者的CD4+T淋巴細胞計數方法簡便、經濟、適用性強［23］，有助于了解機體的免疫狀態以確定疾病分期、檢測疾病進程、評估疾病預后以及評估抗病毒治療療程等，能夠作為我國臨床檢測技術進行推廣。

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（2015-10-14 收稿 2015-11-08 修回）

（責任編委 李 軍 本文編輯 盧福昱）

［文獻標志碼］［中國圖書資料分類號］ R392.12；R512.91 A

［文章編號］1007-8134（2016）03-0176-05

*Corresponding author， E-mail： xiaoyao@chinaaids.cn

［作者單位］730000 蘭州，甘肅省疾病預防控制中心（許亞寧）；102206 北京，中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心（張輝、肖瑤）

［通訊作者］肖瑤， E-mail∶ xiaoyao@chinaaids.cn

Research advances in CD4+T lymphocyte enumeration using two-color CD4/CD45 single-platform protocol in HIV-infected patients

XU Ya-ning， ZHANG Hui， XIAO Yao*
Gansu Center for Disease Control and Prevention， Lanzhou， Gansu 730000， China

［Abstract］CD4+T lymphocyte count is regarded as a major marker for evaluating disease progression and antiretroviral therapy efficacy in HIV-infected individuals. In this review， the authors introduce the development of CD4+T lymphocyte enumeration using flow cytometry， and compare CD4/CD45 two-color single-platform protocol with other protocols in terms of accuracy， reliability and economics. CD4/CD45 two-color single-platform protocol is considered to be convenience， cheap and practical. In addition， the authors introduce specific characteristics and performance of various kinds of flow cytometers using CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration.

［Key words］HIV； CD4 lymphocyte count； antigens， CD45； flow cytometry