60℃加熱1小時滅活病毒方法對常規臨床檢測指標的影響研究

李曉東，廖　昊，劉　妍，李　樂，陳容娟，李　奇，陳　麗，黃鵬宇，王學晶，徐東平

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60℃加熱1小時滅活病毒方法對常規臨床檢測指標的影響研究

李曉東，廖昊，劉妍，李樂，陳容娟，李奇，陳麗，黃鵬宇，王學晶，徐東平

［摘要］目的 基于60 ℃加熱1 h可有效滅活埃博拉病毒的觀點，探討用該條件加熱處理對常規臨床檢測指標的影響。方法 對40例受檢者用枸櫞酸鈉抗凝管和EDTA-K2抗凝管分別采集靜脈血，標本分為2份，檢測未進行加熱滅活處理（滅活前）和進行了加熱滅活處理（滅活后）樣本的生物化學、免疫、凝血和血常規指標，比較熱滅活前后各指標的差異。結果 與滅活前相比，滅活后樣本的生物化學和免疫項目中總蛋白、總膽紅素、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應蛋白、尿素氮、葡萄糖、HBsAb水平差異無統計學意義（P均＞0.05）；白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和乳酸脫氫酶有較顯著降低，但下降幅度不到80％且滅活前、后數據存在相關性（r＞0.80，P＜0.01），用回歸方程校正后檢測數據仍具有參考價值；堿性磷酸酶、γ-谷氨酰基轉移酶、膽堿酯酶和肌酸激酶的測定值下降非常明顯（P均＜0.01），且滅活前后2組數據無顯著相關性。凝血檢測項目中，D-二聚體在2組間的差異無統計學意義（P＞0.05）；其余項目均受到熱滅活嚴重影響。血常規項目中，血紅蛋白、白細胞和血小板計數在2組間的差異無統計學意義（P＞0.05），但樣本須要事先稀釋。結論 60 ℃加熱1 h滅活處理對部分生物化學、免疫和血常規項目無明顯影響，部分項目檢測值明顯降低，但其中有6項指標經校正后仍具參考價值。

［關鍵詞］埃博拉病毒屬；臨床試驗；檢疫

埃博拉病毒主要通過接觸患者或感染動物的血液、體液、分泌物和排泄物等而引起感染，臨床表現主要為突起發熱、出血和多臟器損害［1］。埃博拉病毒對化學藥品敏感，乙醚、去氧膽酸鈉、β-丙內酯、福爾馬林、次氯酸鈉等消毒劑可以完全滅活病毒；鈷60照射、γ射線也可使之滅活。該病毒在常溫下較穩定，在4 ℃存放1個月，感染性無明顯變化，但對加熱比較敏感，我國《埃博拉出血熱防控方案》中明確60 ℃加熱1 h或100℃加熱5 min即可滅活［2］。

埃博拉病毒的傳染性強，接觸患者和患者樣本須要高度防護［3］。對患者樣本檢測須在移動生物安全防護三級（P3）實驗室中進行，但受限于空間狹小，不適宜在內開展臨床常規實驗指標的檢測。由于無臨床實驗室檢測指標，使患者的治療以及相關科研工作受到極大影響。如果對患者血液標本在P3實驗室中進行簡單地離心和加熱滅活處理，再對滅活后的血液或血清標本在常規實驗室進行相關臨床實驗指標的檢測，既可解決P3實驗室條件限制，又可消除實驗室工作人員在檢測中的感染風險。本研究通過對樣品加熱60 ℃ 1 h以模擬滅活埃博拉病毒的條件，分析滅活前和滅活后臨床實驗指標的差異，為今后在沒有P3實驗室條件下通過熱滅活病毒開展臨床實驗檢測提供參考。

1　對象與方法

1.1 對象 共40例受檢對象，其中20例為解放軍第三○二醫院收治的慢性HBV感染者，20例為健康志愿者。

1.2 儀器 生物化學項目由日立生物化學分析儀

（日本）完成檢測，免疫項目由羅氏化學發光免疫分析儀（日本）完成檢測，血凝項目由希斯美康血凝分析儀（日本）完成檢測，血紅蛋白由希斯美康血細胞分析儀（日本）完成檢測，血小板和白細胞由2人分別計數各3次，取平均值。加熱滅活采用恒溫水浴箱（中國上海）中60 ℃放置1 h。

1.3 血液樣品處理方法 對每例受試對象分別用枸櫞酸鈉抗凝管和EDTA-K2抗凝管抽取2管外周靜脈血。其中枸櫞酸鈉抗凝管血液樣品進行離心后，將血漿平均分成2份，取其中1份樣本進行加熱處理，隨后對2份樣本同時進行生物化學項目、免疫項目和血凝項目檢測。將EDTA-K2抗凝管樣品平均分為3組共6份：其中2份用0.9％氯化鈉稀釋5倍以防止加熱過程中血液凝固，取其中1份樣本進行加熱處理，隨后對2份樣本同時進行血紅蛋白檢測；另外2份用1％草酸銨稀釋20倍破壞血液中的紅細胞和白細胞，取其中1份樣本進行加熱處理，隨后對2份樣本同時進行血小板計數；另外2份用3％冰醋酸稀釋20倍溶解血液中的紅細胞，取其中1份樣本進行加熱處理，隨后對2份樣本同時進行白細胞計數。

1.4 結果評價 對滅活前和滅活后的樣本檢測數值進行比較，差異無統計學意義，表明加熱處理對該檢測指標無顯著影響。加熱后檢測值變化幅度＜5倍，且統計分析熱滅活前、后兩組的檢測值有顯著相關性時，建立回歸方程校正檢測結果。加熱后檢測值變化幅度5倍以上時，提示該指標不適于加熱后檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16 .0軟件進行統計分析。計量資料呈符合正態分布，用±s表示，各指標熱滅活前后水平差異比較用自身配對t檢驗。對部分指標熱滅活前后水平進行直線回歸分析。檢驗水準a=0.05。

2　結　　果

2.1 生物化學和免疫檢測項目 滅活前組與滅活后組相比，總蛋白、總膽紅素、肌酐、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應蛋白、尿素氮、葡萄糖和HBsAb水平差異無統計學意義（P均＞0.05）；白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和乳酸脫氫酶水平差異有統計學意義（P均＜0.01），但2組數據存在相關性（r＞0.80，P＜0.01）；堿性磷酸酶、γ-谷氨?；D移酶、膽堿酯酶和肌酸激酶的差異有統計學意義（P均＜0.01），2組數據無相關性（P＞0.05）。見表1。

2.2 血常規和凝血檢測項目 滅活前組與滅活后組相比，血常規項目血紅蛋白、白細胞和血小板計數差異無統計學意義（P均＞0.05）；凝血檢測項目D-二聚體差異無統計學意義（P＞0.05），其余項目如凝血酶原活動度、凝血酶原時間、纖維蛋白原等均受到熱滅活嚴重影響，無法得到具體數值。見表2。

2.3 檢測項目結果校正 為了對熱滅活后檢測數值下降5倍以內的項目進行校正，即用滅活后的檢測值反推滅活前的檢測值（真實值），對滅活前后的指標數值進行直線相關和回歸分析，得到的回歸方程和相關系數，如表3和圖1所示。

3　討　　論

2014年3月非洲暴發的埃博拉疫情嚴重威脅世界公共衛生安全［4］。埃博拉病毒易于在人群中傳播，感染后病死率較高，國家衛生和計劃生育委員會將其歸屬于第一類、四級生物危害等級的病原微生物［5］。培養埃博拉病毒必須在生物安全四級實驗室，常規實驗室檢測須在P3實驗室內進行［6］。目前我國和非洲均缺乏P3實驗室，而且很多臨床檢測項目在P3實驗室中無法進行。對埃博拉病毒感染患者治療須要監測肝、腎、心功能等生物化學和免疫指標。如果不作任何處理即對血液進行相關臨床項目檢測，極易因職業暴露增加醫護工作者感染風險［7］。在檢測之前先進行病毒滅活處理，可消除檢測人員的職業暴露危險。

埃博拉出血熱防控方案明確了60 ℃加熱1 h可徹底滅活埃博拉病毒［2］。在本研究中我們對血液樣本進行了同樣的處理，發現滅活處理對總蛋白、總膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、鈉、鉀、氯、C-反應蛋白、肌酐、尿素氮、葡萄糖、 HBsAb、血紅蛋白、白細胞、血小板計數和D-二聚體這些指標無顯著影響，此前國外的研究結果也得到了類似的結論［8-10］。白蛋白、球蛋白、前白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶和乳酸脫氫酶等指標熱滅活前后數值差異有統計學意義，可以通過線性回歸方程校正滅活后的結果，使其仍具有臨床參考價值。堿性磷酸酶、 γ-谷氨?；D移酶、膽堿酯酶、肌酸激酶等指標受加熱滅活的影響顯著，無法通過校正得到有意義的檢測結果。此外，熱滅活后凝血功能相關的蛋白活性明顯下降，無具體的檢測結果，不建議熱滅活后檢測。因此本研究結果提示，對于熱滅活后數值降低在5倍以內的指標，可以通過標準品進行校正。即已知濃度的標準品與檢測樣品采取相同的處理措施，然后用標準品的檢測值建立回歸方程，將待測樣品滅活后的檢測值代入方程即可得到滅活前的校正檢測數值。

表1　生物化學和免疫檢測項目熱滅活前后結果Table 1 Biochemical and immunological indicators before and after heating inactivation

表2　白細胞、血小板和血紅蛋白熱滅活前后檢測結果Table 2 WBC， PLT and HGB levels before and after heat inactivation

表3　熱滅活后部分檢測項目結果的校正方程Table 3 Regression equation of some laboratory indicators after heating inactivation

圖1　部分檢測指標熱滅活前后水平散點圖注：ALB.白蛋白； GLO.球蛋白； PAL.前白蛋白； ALT.丙氨酸氨基轉移酶； AST.天冬氨酸氨基轉移酶； LDH.乳酸脫氫酶Figure 1 Scatter plot of some laboratory indicators before and after heating inactivation

本研究涵蓋了大多數常規實驗室檢測項目，一般情況須要應用3種采集管：真空干燥管用于生物化學及免疫項目的檢測，枸櫞酸鈉抗凝管用于凝血項目的檢測，EDTA-K2抗凝管用于血常規的檢測。本研究直接應用血漿進行生物化學項目檢測，減少了對受試者血液采集量，簡化了操作步驟，可提高P3實驗室的檢測效率。

本研究的結果顯示加熱滅活處理對大部分生物化學和免疫項目并無影響或影響較小，部分檢測項目可通過校正消除影響。60 ℃1 h加熱滅活埃博拉病毒不需昂貴的儀器設備，簡單易行，對多數臨床檢測項目結果不會造成影響，且部分可以校正，可考慮作為一種臨床實驗室工作人員防止醫源性感染切實可行的標本處理方法。

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［4］ 張云輝， 王姝， 陳玉琪， 等. 埃博拉出血熱研究現狀及2014年疫情進展［J］. 傳染病信息， 2014， 27（4）：3-8.

［5］ 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.衛生部關于印發《人間傳染的病原微生物名錄》的通知［EB/OL］. ［2015-08-16］. http：//www.nhfpc.gov.cn/zhuzhan/wsbmgz/201304/ 64601962954745c1929e814462d0746c.shtml.

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（2015-11-27 收稿 2016-01-20 修回）

（責任編委 曲 芬 本文編輯 張云輝）

［文獻標志碼］［中國圖書資料分類號］ R512.62 A

［文章編號］1007-8134（2016）03-0160-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.009

*Corresponding author. WANG Xue-jing， E-mail： wangxuejing@263.net； XU Dong-ping， E-mail： xudongping302@sina.com

［基金項目］北京市科委科技計劃項目（D131100005313016），全軍醫學科技“十二五”科研項目重點課題（BWS11J048），新發突發傳染病研究北京市重點實驗室資助項目（2014XFTF04）

［作者單位］100039 北京，解放軍第三〇二醫院臨床研究管理中心（李曉東、廖昊、劉妍、李樂、陳容娟、李奇、陳麗、黃鵬宇、徐東平）；100123 北京，民航總醫院檢驗科（王學晶）

［通訊作者 ］王學晶，wangxuejing@263.net； 徐東平，E-mail∶xudongping302@sina.com

Effects of sample processing by heating at 60 ℃for one hour on routine clinical laboratory indicators

LI Xiao-dong， LIAO Hao， LIU Yan， LI Le， CHEN Rong-juan， LI Qi， CHEN Li， HUANG Peng-yu， WANG Xue-jing*， XU Dong-ping*
Research Center for Clinical and Translational Medicine， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Objective To evaluate the influence of the heating procedure on clinical laboratory indicators based on the understanding that heating at 60 ℃ for 1 hour is an effective assay for inactivation of Ebola virus. Methods Blood samples of 40 subjects involved in this study were collected in sodium citrate anticoagulation tubes and EDTA-K2 anticoagulation tubes respectively， and divided into two equal aliquots. One aliquot was analyzed for biochemical， immunological， coagulation and blood routine examination parameters without preheating （prior-inactivation group）， and the other was analyzed for these parameters after heating at 60 ℃ for 1 hour （post-inactivation group）. The differences in these parameters between prior-inactivation group and post-inactivation group were compared. Results In terms of biochemical and immunological tests， as compared with prior-inactivation group， total protein， TBIL， CRE， TC， TG， NA， K， CL， CRP， BUN， GLU and HBsAb in post-inactivation group were not significantly different （P＞0.05）； ALB， GLO， PAL， ALT， AST and LDH decreased significantly， but the decreased variations were less than 80％ and there was a correlation between the levels of the two groups （r＞0.80， P＜0.01）， thus the data were still interpretable after calibration with regression equation； ALP， GGT， CHE and CK had a significant decrease （P＜0.01） and no correlation was observed between the two groups. In terms of coagulation tests， D-dimer showed no significant difference between the two groups （P＞0.05）； the other coagulation indicators were significantly different between the two groups. In terms of blood routine tests， HGB， WBC and PLT had no significant differences between the two groups （P＞0.05）， provided that samples were diluted beforehand. Conclusions Heat inactivation at 60 ℃ for 1 hour has no significant influence on some biochemical， immunological and blood routine tests， but significantly affects some other tests， among which 6 items are still interpretable after calibration.

［Key words］Ebolavirus； clinical trial； quarantine