上皮-間質轉化在乳腺癌中的研究進展

張 彤 綜述,韓 靜 審校

(天津港口醫院胸外科 300456)

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上皮-間質轉化在乳腺癌中的研究進展

張 彤 綜述,韓 靜 審校

(天津港口醫院胸外科 300456)

乳腺腫瘤；上皮-間質轉化；侵襲；轉移；綜述

1982年Greenburg等[1]首次提出了上皮-間質轉化(EMT)的概念，他們在細胞試驗中證實上皮細胞會暫時失去極性，表現出間質細胞具有的遷移特性。研究人員將EMT依照其發生的生物學背景分為3種亞型。Ⅰ型EMT主要參與哺乳動物的胚層分化、器官形成及神經系統分化。Ⅱ型EMT主要參與創傷愈合、組織再生及器官纖維化[2]。Ⅲ型EMT與惡性腫瘤的發生發展密切相關，大量對人類癌癥的研究已證實這點。原發腫瘤中的上皮樣腫瘤細胞通過EMT的方式轉變為轉移性腫瘤細胞，并在某些情況下，再通過“間質-上皮轉化(MET)”的方式在遠處形成次級轉移瘤[3]。EMT協同MET調節細胞可塑性，在腫瘤侵襲、轉移及治療抵抗方面扮演重要的角色。本文對乳腺癌EMT形成的相關影響因素及EMT形成對乳腺癌疾病演變及治療影響的研究進展進行綜述。

1 乳腺癌與EMT

已有大量研究證實腫瘤相關EMT的形成在小鼠和人類乳腺癌細胞系及實體瘤中確實存在，但這些在實驗系統中建立的EMT模型，其臨床相關性仍不明確。麻省總醫院癌癥中心Shyamala的最新研究描述了乳腺癌患者體內循環腫瘤細胞(CTCs)中EMT形成的特點，證實了EMT在人類乳腺癌的血液播散中起到了一定作用[4]。

EMT的形成受到多種因子調控，涉及多個信號轉導通路及復雜的分子機制，與microRNA及腫瘤微環境等相關。最新研究發現，EMT的形成與lincRNA Hotair的表達增加及線粒體逆行信號通路相關[5-6]。在對乳腺癌及其他多種癌癥的研究中發現，許多誘導Ⅲ型EMT形成的調控因素在Ⅰ型EMT中也發揮重要作用，表明在健康人當中不恰當的激活相關調控因素(如：轉錄因子Twist1、Six1、Snail1、LBX1及信號通路Wnt、TGF-β等)可形成Ⅲ型EMT，導致惡性腫瘤的發生和發展[7]。

1.1 EMT形成的相關調控因子 EMT形成的特點是上皮細胞標志物表達下調，如E-鈣黏蛋白、閉合蛋白、緊密連接蛋白和橋粒斑蛋白等受到轉錄抑制，使細胞間黏附喪失。同時伴隨間質細胞標志物表達上調，包括N-鈣黏蛋白、細胞角蛋白、肌動蛋白和纖連蛋白等。E-鈣黏蛋白為EMT發生的重要分子，與腫瘤的侵襲轉移關系密切。有研究發現[8]，單純破壞細胞間黏附并不能造成腫瘤細胞轉移，而單獨敲除CDH1(E-鈣黏蛋白基因)造成E-鈣黏蛋白表達缺失，可有效誘發EMT導致腫瘤細胞轉移。轉錄因子Snail、Slug、ZEB1/ZEB2及Twist1/Twist2可直接作用于CDH1啟動子上的E-boxs序列，抑制其轉錄，從而促進EMT形成。還有一類轉錄因子可通過間接抑制CDH1促進EMT發生，包括Six1、GSC及FOXC2等。在MCF7乳腺癌細胞系中，Six1通過激活TGF-β信號通路下調E-鈣黏蛋白，誘發腫瘤相關EMT。GSC通過激活SNAI1/SNAI2及Twist1誘導Ⅲ型EMT形成。在對乳腺癌EMT形成機制的探索中，更多的作用于EMT形成的相關因子被發現。SOX4被發現在人乳腺癌臨床標本中異常過表達，實驗表明過表達SOX4使永生化人乳腺上皮細胞獲得間質細胞特性，增強細胞遷移、侵襲能力，SOX4正調控已知EMT誘導因子表達，激活TGF-β信號通路，促進EMT形成[9]；最新研究報道，SOX4通過上調表觀遺傳修飾符Ezh2的表達促進EMT形成[10]。Huang等[11]研究發現，CCN6蛋白表達下調與乳腺癌細胞EMT形成相關，與乳腺癌腋下淋巴結轉移相關。在乳腺癌細胞中穩定敲除CCN6，可通過激活IGF-1受體信號通路在RNA及蛋白水平上上調Snail及ZEB1表達，間接抑制E-鈣黏蛋白等上皮細胞標記物表達，同時上調間質蛋白，從而誘導EMT形成。Zhao等[12]的研究表明ING5通過抑制PI3K/AKT信號傳導通路，從而抑制乳腺癌細胞的EMT轉換。有研究表明CPEB1通過調控MMP9 mRNA的表達從而影響乳腺癌細胞發生EMT，從而抑制了乳腺癌的轉移。

1.2 EMT形成的主要信號通路 EMT形成通過精確的細胞內信號轉導機制調控，多種細胞外信號通過與細胞表面的特異性受體結合，將信號傳導到細胞內，通過相應的細胞內信號轉導通路，激活相關轉錄因子調節基因表達，從而完成EMT。EMT的發生涉及多條信號通路，主要有：TGF-β、PI3K/AKT、Ras/MAKP、Wnt、Notch以及Hedgehog等信號通路。這些信號通路通過激活相關轉錄因子發揮作用，如：TGF-β可使Snai1/2、Twist1及ZEB1/2活化，還可上調FOXC2，從而誘導EMT形成。此外Notch、Hedgehog及Wnt通路通過激活Snai1/2作用于EMT。一些轉錄因子還可反作用于相關信號通路促進EMT發生，如：Six1可激活TGF-β和Wnt通路。TGF-β、經典及非經典Wnt3條信號通路協同作用可誘導細胞發生EMT，之后通過自分泌的方式維持間質細胞狀態；研究人員證實在上皮細胞中下調內源性自分泌信號抑制因子可誘導細胞激活EMT程序；相反，在細胞中添加相關信號通路抑制劑破壞自分泌信號，發現原代乳腺上皮細胞遷移及自我更新能力受到抑制，并降低了轉化衍生物誘導的腫瘤形成及轉移。在對人類乳腺癌患者的最新研究證實了TGF-β介導上皮細胞向間質細胞轉化，并觀察到TGF-β為血小板來源。

1.3 MicroRNAs與EMT形成 研究發現miR-200家族等多種miRNA參與調控腫瘤EMT形成。在體外試驗中miR-200家族可以抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的能力，還可通過下調ZEB1和ZEB2，增加E-鈣黏蛋白表達，抑制EMT發生[13]。目前哈佛醫學院Song等[14]的研究發現miR-22作為一種至關重要的表觀遺傳修飾符，在乳腺癌中促進EMT形成及干細胞特性的獲得，促進癌癥轉移；試驗中他們還發現在小鼠模型中miR-22可通過直接靶向起到腫瘤抑制作用的TET蛋白沉默對抗癌轉移的miR-200。Cai等[15]研究發現，在體外及體內試驗中，miR-374a在乳腺癌細胞系中的異常過表達可直接抑制多種Wnt/β-catenin信號級聯反應的負調節蛋白，如：WIF1、PTEN和WNT5A，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，促進EMT發生。此外還有關于miR-145、miR-221/222等多種miRNA作用于腫瘤EMT的報道，它們通過不同的作用機制參與調控乳腺癌EMT過程，在其中發揮抑癌與促癌的雙重作用[16-17]。

1.4 腫瘤微環境與EMT形成 腫瘤微環境是指在腫瘤細胞周圍區域中與其相互作用的非腫瘤細胞與基質，包括細胞外基質、成纖維細胞、肌纖維母細胞以及免疫細胞等。隨著腫瘤進展，腫瘤微環境可有效阻斷來源于宿主的細胞毒信號，促進炎性反應，募集腫瘤浸潤的淋巴細胞以適應宿主反應，這些腫瘤細胞、周圍基質與炎癥細胞間的相互應答，產生MMPs、ECM、生長因子及細胞因子等誘導局部組織重塑，導致EMT發生。最新研究發現，腫瘤微環境中的炎癥因子TNF-α及IL-1β長期刺激癌旁的正常乳腺上皮細胞可導致其結構重塑及EMT形成，導致正常組織的惡變及疾病復發擴散。

2 EMT對乳腺癌預后及治療的影響

2.1 EMT與乳腺癌侵襲轉移 關于腫瘤侵襲轉移的相關研究認為，在原發腫瘤侵襲轉移的起始，癌細胞通過EMT獲得間質細胞表型特征，穿透基底膜，發生內滲；在轉移的終末，具有間質特性的腫瘤細胞通過MET重新獲得上皮細胞特征，進而外滲發生微轉移。在腫瘤相關EMT發生的過程中，癌細胞具有抗凋亡、免疫耐受、干細胞等特性，增加了腫瘤細胞侵襲轉移能力。

2.1.1 EMT與細胞抗凋亡特性 細胞發生EMT后對一些因素導致的凋亡可產生一定的抵抗性。發生EMT的細胞可活化抗凋亡信號通路以及分泌抗凋亡因子。來源于不同哺乳動物的多種上皮細胞(如：NMuMG和KIM-2等)經誘導發生EMT后，對紫外線照射引起的細胞凋亡具有明顯抵抗。EMT是抑制失巢凋亡的一個重要過程，在乳腺腫瘤發生模型中,E-鈣黏蛋白的缺失參與抗失巢凋亡,促進血管形成,利于腫瘤轉移擴散。有研究表明，EMT相關轉錄因子Snail在原發性乳腺癌和淋巴結陽性乳腺癌中過表達,它抑制E-鈣黏蛋白基因的轉錄,并激活抗凋亡基因。有學者認為，細胞發生EMT的過程使得細胞暫時逃避了失巢凋亡反應的發生，而非細胞本身產生了抗凋亡特性，這一點更有可能是癌細胞不斷增殖而不發生凋亡的原因。

2.1.2 EMT與乳腺癌干細胞特性 腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞，稱為腫瘤干細胞。乳腺癌干細胞的起源尚未完全明確，目前的研究認為可能來源于正常干/祖細胞的惡性轉化。將乳腺癌患者胸腔積液中分離得到的乳腺癌干細胞移植到SCID小鼠的過程中，發揮了其致癌的能力。乳腺癌中CD44+/CD24-表型的細胞被認為是富集乳腺癌干細胞的細胞群，具有更強的侵襲和轉移能力，對常規放化療具有耐受性。

在人乳腺上皮細胞(HMECs)中，CD44+/CD24-細胞表現出與EMT相關的表型；通過TWIST1，SNAI1，TGF-β1等誘導腫瘤相關EMT形成，可導致CD44+/CD24-細胞和腫瘤形成升高，以上證明了EMT誘導物與腫瘤干細胞形成的因果關系[18]。Mani等[19]在體外試驗中發現，在永生性人類乳腺上皮細胞中通過Twist或Snail轉錄因子誘導EMT發生，可使CD44+/CD24-腫瘤干細胞標記物表達增加；他們在進一步研究中首次報道了，在體外及體內試驗中，EMT相關調控因子FOXC2在人類乳腺上皮細胞中異位表達足以引發EMT并使細胞獲得干細胞樣表型[20]。癌細胞發生EMT并獲得干細胞特性后，其促進腫瘤形成的分子機制仍不十分明確。

2.1.3 EMT與免疫調節 有研究[21]證實，由轉錄因子Snail誘導的EMT可通過免疫抑制作用于腫瘤細胞轉移，由Snail誘導形成典型EMT特征的鼠類和人類黑色素瘤細胞中，可部分通過血小板反應蛋白-1(TSP-1)產物誘導調節性T細胞和腫瘤組織中受損的樹突狀細胞抑制免疫反應。同時研究還發現Snail過表達的黑色素瘤細胞對免疫治療不敏感，但在瘤內注射Snail基因特異性siRNA和抗TSP-1單克隆抗體后，即可刺激腫瘤浸潤性淋巴細胞增生和全身免疫反應，從而抑制腫瘤的生長和轉移。

2.2 EMT與乳腺癌治療抵抗 化療耐藥是腫瘤治療中的難題。最近的研究證據表明，在乳腺癌及其他多種癌癥中EMT的形成與化療耐藥相關。這種EMT相關耐藥表型不僅出現在對傳統化療藥物(如：紫杉類、鉑類、蒽環類)的耐藥中，還出現在靶向藥物及內分泌治療藥的耐藥中。

有研究[22]表明，在阿霉素和紫杉醇及多西他賽耐藥的MCF-7細胞系中，細胞獲得間質表型特征，發生EMT過程，其中Slug表達上調，E-鈣黏蛋白、閉合蛋白表達抑制，N-鈣黏蛋白、波形蛋白表達激活，ER-α水平的下降可能與Slug表達上調相關；免疫組化結果顯示，在耐藥MCF-7細胞系中，ER和E-鈣黏蛋白表達缺失，伴隨波形蛋白高水平表達。同樣的細胞系，在耐他莫昔芬情況下觀察到，細胞在形態學上發生了EMT改變，耐藥株出現波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達上調，β-連環蛋白酪氨酸磷酸化水平上調以及β-連環蛋白與E-鈣黏蛋白結合的消失。Li等[23]研究發現，在乳腺癌MCF-7細胞系中，阿霉素可同時誘導細胞凋亡與EMT發生，而只有發生EMT過程的細胞表現出了多藥耐藥與高侵襲特性；高表達的Twist1被發現是這一過程的關鍵因素，將發生間質轉化的MCF-7細胞用小分子干擾RNA技術敲除Twist基因，可以逆轉細胞的多藥耐藥性，提高其對藥物的反應性。以上研究證實了EMT的發生與多藥耐藥發生相關。

在體外試驗中，正常細胞和腫瘤細胞誘導發生EMT后，對于藥物的抵抗性均增加，可見這種耐藥性的增加并非源于致瘤性轉化；前面已提到EMT可賦予細胞干細胞特性，而試驗也表明治療抵抗的發生與無法消滅這種干細胞特性而造成新的腫瘤再生相關。那么，更為有效的治療應同時關注于干細胞耐藥及EMT的發生，逆轉EMT使得細胞獲得干性減弱可有效控制腫瘤，目前對于新治療方法的探索已關注于EMT樣細胞與腫瘤干細胞潛能獲得。Asiedu等[24]研究發現，AXL上調可誘導EMT發生并調節乳腺癌干細胞功能，通過MP470下調AXL可逆轉EMT，減弱乳腺癌干細胞自我更新能力并增加其化療敏感性；若靶向AXL并聯合系統治療，則有潛力提高抗癌藥物反應,減少乳腺癌復發和轉移。

3 結 語

EMT是癌癥病程中的一個關鍵事件，臨床研究已證實其在人類乳腺癌血液傳播中確實發揮作用。有研究表明[25]，用于晚期乳腺癌的抗癌新藥恩替諾特(ENT)可通過增加E-鈣黏蛋白表達活性，逆轉EMT發生過程，降低癌癥轉移，這為癌癥治療提供了新的途徑。但目前針對EMT的相關研究仍多數基于體外試驗模型，對影響其發生的多種因素、復雜分子機制，以及EMT在癌癥侵襲、轉移和治療耐藥等方面的臨床相關性仍需提供更多的證據。有研究從臨床角度討論了一些腫瘤細胞分化和轉移的爭論，提出證據表明某些上皮型癌細胞在整個轉移過程中一直維持上皮形態[26]。因此，關于EMT的形成機制仍需進一步研究。這將有助于今后探索更為精確有效的乳腺癌靶向治療方案。

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張彤(1973-)，本科，副主任醫師，主要從事胸外科與胸腺外科方面的研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.038

R737.9

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1671-8348(2016)33-4722-04

2016-04-22

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