shAkt2慢病毒表達載體的構建及其對H292細胞增殖和凋亡的影響*

蔣莉　劉丹　李為民　陳渤江

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大學華西醫院呼吸科, 四川 成都 610041)

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shAkt2慢病毒表達載體的構建及其對H292細胞增殖和凋亡的影響*

蔣莉1,2劉丹2李為民2陳渤江2

(1.川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大學華西醫院呼吸科, 四川 成都 610041)

【摘要】目的構建shAk2基因慢病毒表達載體，獲得穩定干擾Akt2基因的細胞克隆，建立靶向沉默Akt2的非小細胞肺癌穩定細胞株，并探討Akt2基因在非小細胞肺癌中的作用。 方法根據shRNA干擾序列設計原則，設計并合成針對Akt2靶基因的雙鏈寡核苷酸序列，經退火、酶切、連接反應，將干擾序列插入pLKD.CMV.GFP.U6質粒，經感受態細胞轉化、陽性克隆測序鑒定所插入的片段，抽提重組質粒及輔助包裝元件載體質粒p-Helper1.0和p-Helper2.0，通過陽離子脂質體lipofectemin2000介導細胞轉染及慢病毒包裝，收集濃縮病毒進行滴度測定，感染至人肺腺癌細胞H292，通過無菌流式細胞分選GFP強陽性細胞，應用Western-blot驗證干擾效果。CCK-8比色法檢測細胞增殖，Annexin V．FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。 結果與正常對照組比較，shAkt2組細胞中Akt2蛋白水平減少90.89%，提示靶向抑制Akt2的慢病毒shRNA表達載體構建成功，并獲得穩定抑制Akt2基因表達的細胞克隆。CCK-8法檢測細胞增殖能力，shAkt2組細胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明顯減低(P<0.05)，干擾Akt2基因表達后顯著抑制細胞增殖速率。采用Annexin-V/7-AAD流式細胞分析法檢測各組中凋亡細胞的比例，shAkt2組凋亡率顯著高于NC及NSCLC組(P<0.05)。 結論靶向干擾Akt2基因表達可抑制肺腺癌細胞株H292細胞的增殖能力，促進其凋亡。

【關鍵詞】非小細胞肺癌; Akt2 慢病毒載體; 細胞增殖; 凋亡

Construction of a recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2 and it’s effects on proliferation and apoptosis in H292 cell linesJIANG Li1,2, LIU Dan2, LI Weimin2,etal

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchongCentralHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofNorthSichuan

MedicalUniversity,Nanchong637000,Sichuan,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct the lentivirus shRNA vector targeting Akt2 and observe the biological behaviors of NSCLC cell lines after Akt2 knockdown and intensify the downstream regulation mechanisms in NSCLC. MethodsSequences for targeting the Akt2 gene was selected. The double strand shRNA oligo was ligated to pLKD.CMV.GFP.U6 lentivirus vector. The construct was verified by sequencing. The viral particles were collected and infected NSCLC cells. After selection of GFP positive cells by FACS, protein expression levels of Akt2 were determined by Western blot. The study was divided into 3 groups, including shAkt2 cells, negative control (NC) and NSCLC normal control groups. Cells were characterized in vitro using proliferation assay and apoptosis analysis. ResultsshAkt2 stable transfected cells were purified by FACS with GFP marker. The ratio of selection was 90%-95%. Efficacy of Akt2 knockdown was determined by western blot. Our data showed that protein expression level of Akt2 was inhibited by 90% compared with control groups, and Stable knockdown of Akt2 in NSCLC cells was successfully established. Knockdown of Akt2 in NSCLC cells significantly inhibited cell proliferation and promoted cell apoptosis in H292 cell lines (allP<0.05). ConclusionShAkt2 could significantly inhibit the Akt2 expression levels in H292 cell lines. Akt2 plays a pivotal role in NSCLC cell differentiation, growth. These results supply new potential therapeutic target for NSCLC intervention.

【Key words】Lung carcinoma； RNA interference； Lentiviral vector； Cell proliferation

Akt是人類染色體基因組中鼠類胸腺淋巴瘤病毒(T-8 strain from AKR/J mouse, Akt8)致癌基因(v-Akt)的同源物，因其蛋白質產物是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與蛋白激酶A、C高度同源，又被命名為蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)[1]。共有Akt1、Akt2、Akt3 3種亞型，分別調節不同的生物學行為。Akt2是Akt的重要亞型，以磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)依賴的方式激活，能磷酸化一系列下游蛋白，通過多種途徑調節細胞增殖、分化、轉移及凋亡[2，3]。細胞凋亡在腫瘤的進展和耐藥中都起到了重要作用，Akt可通過調節下游的凋亡相關蛋白的表達及磷酸化水平參與細胞凋亡途徑。研究發現Akt2在肺癌組織中表達增高并與預后相關[4]，但其介導的特異性信號通路尚未闡述清楚。本研究通過靶向沉默Akt2基因的慢病毒表達載體技術，探討Akt2對肺腺癌細胞株H292細胞增殖能力和細胞凋亡的影響。

1材料和方法

1.1材料人肺癌細胞株H292及人胚腎293T細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；慢病毒載體及包裝系統載體pLOV.ubc.eGFP購于紐恩(上海)生物科技有限公司；Enhanced infection solution(ENI．S)、polybrene、含無義序列的shRNA及綠色熒光蛋白(GFP)標記對照慢病毒載體、小干擾序列和引物購于上海吉凱基因技術公司；2000DMEM、FBS購于hyclone；primer(R&F)、Trizol、Lipofectamine、positive clone 測序及逆轉錄試劑盒購于Invitrogen公司；BamHI、EcoRI等限制性內切酶購于New England Biolabs；SYBR TAQ Real-time試劑盒購于Bio-Rad公司；質粒抽提試劑盒購于Qiagen公司；Cell Counting kit-8 (CCK-8) Dojindo公司；V-APC/7AAD、蛋白抽提試劑盒購于南京凱基生物科技公司，BCA protein assay kit購于Pierce公司；兔抗人AKT2抗體、Western 抗兔二抗購于 Cell Signaling Technology；Luminata Western HRP substrate、PVDF膜購于Millipore公司；預染蛋白Marker購于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1ShAKT2慢病毒載體的構建利用NCBI查找Akt2基因的mRNA序列(NM_001626, 5263 bp mRNA linear)，根據RNA干擾設計序列原則及既往文獻報道，采用Invitrogen公司BLOCK-iT在線設計并進行評估測定，選擇最佳動力學參數靶點于紐恩公司合成含干擾序列的dsDNA oligo。經分別構建質粒，轉染293T細胞，據其對Akt2的抑制率，確定有效靶序列為5′-CCGGGCACAGGTTCTTCCTCAGCT TCAAGAGAGCTGAGGAAGAACCTGTGCTTTT TTg -3′,5′-AATTCAAAAAAGCACAGGTTCTTC CTCAGCTCTCTTGAAGCTGAGGAAGAACCTGT GC -3′。含無義序列的shRNA慢病毒載體作為對照。合成靶片段退火后形成雙鏈DNA，與經Age I和EcoR I雙酶切后的pGCSIL-PUR載體相連，轉化DH5ct大腸桿菌。挑取重組陽性克隆行聚合酶鏈反應(PCR)及送測序鑒定。PCR鑒定引物根據Primer 5.0軟件設計，Primer(+)：5′-CCTATTTCCCATG ATTCCTTCATA -3′Primer(-)：5′-GTAATACGG TTATCCACGCG-3′。

1.2.2慢病毒重組體的包裝取對數生長期的293T細胞，調整細胞密度1.2×107細胞/20ml，接種于15cm細胞培養皿中，37℃、5%CO2培養箱內培養，24小時后細胞密度約70~80%時加pLKD.CMV.GFP.U6質粒、質粒(psPAX2 質粒和pMD2.G 質粒進行感染。48 h后收集病毒上清液，于4℃4000×g離心10 min，再用直徑為0.46 μm的PVDF濾膜過濾后，上清分裝，用于病毒滴度測定和細胞轉染。

1.2.3實驗分組正常對照組(H292組)，為未感染慢病毒載體的H292細胞。陰性對照組(NC組)，為陰性對照病毒轉染NSCLC細胞。實驗組(shAkt2組)，穩定干擾Akt2的NSCLC細胞克隆。

1.2.4.細胞培養、病毒轉染和克隆篩選①細胞培養及病毒感染，H292細胞用含10%FBS的RPMI 1640培養基于37℃，5%CO2，的培養箱中培養。細胞生長狀態良好后，以5×104/孔接種于6孔板內，培養12~24 h，待細胞匯合度達30%，加入108TU/ml病毒150ul (MOI：75)轉染，以GFP標記的慢病毒相同條件同時感染細胞觀察感染效率。8 h后更換新鮮培養基。感染后72 h，分別行熒光定量PCR和Western blot免疫印跡檢測SLC35F2表達水平。②克隆篩選，流式細胞分選成功感染shAkt2細胞同時表達報告基因GFP蛋白，以GFP為標記獲得高純度穩定轉染shAkt2的細胞克隆。

1.2.5Western blot免疫印跡根據凱基生物蛋白抽提試劑盒操作說明抽提細胞蛋白。經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V恒定電壓轉膜，封閉過夜，Akt2一抗工作濃度1∶1000，二抗工作濃度1∶5000，β-actin一抗工作濃度1∶10 000，二抗工作濃度1∶10000。采用Millipore公司Luminata Crescendo Western HRP substrate顯色液孵育3min，放入暗盒(感光時間根據熒光條帶的強弱來判定)曝光，取出X光片，放入自動洗片機顯影定影后用柯達掃描儀將條帶掃描至電腦保存。Quantity one分析軟件測定條帶灰度。

1.2.6CCK-8檢測細胞增殖將對數生長的3組細胞計數并鋪板于96孔板上(2×103/孔)，每組3復孔。置于37℃、5% CO2培養箱培養1~4d，每24h測量一次細胞生長狀況。測量前，向檢測孔加入10μl CCK-8試劑，放入培養箱培養1.5h。酶標儀測定在450nm處的吸光度。以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.7Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化收集3組細胞。用PBS洗滌細胞2次(2000rpm離心5min)收集1～5×105細胞。加入500μL的Binding Buffer重懸細胞。加入5μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD染液，混勻。室溫、避光、反應5～15min。在1 h內，進行流式細胞儀的觀察和檢測。激發波長633nm，最大發射波長660 nm，Annexin V-APC的紅色熒光使用FL4通道檢測；激發波長Ex=546 nm；發射波長Em=647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測。

2結果

2.1Akt2-ShRNA慢病毒載體的鑒定挑選的陽性克隆行PCR鑒定，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為343 bp，未連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為：306 bp，鑒定結果與預期相符(見圖1)。經兩次獨立測序證實合成的Akt2-ShRNA寡核苷酸鏈和陰性對照序列插入正確。

圖1pGCsil-shAkt2-GFP質粒菌落PCR電泳圖

Fig 1PCR electrophoresis of pGCsil-shAkt2-GFP plasmid colony

注：1.空載體對照組；2.Marker；3，7， 9，10，11，12.陽性克隆；8.測序

挑選重組質粒陽性克隆送至Invitrogen公司測序。結果顯示：陽性克隆序列內含有干擾Akt2的shRNA片段序列，片段序列為：CcggGCACAGGTT CTTCCTCAGCTTCAAGAGAGCTGAGGAAGAA CCTGTGCTTTTTg，片段大小為57bp，與之前所設計的針對Akt2的shRNA片段序列完全符合。證明shAkt2序列已成功克隆到慢病毒pLKD.CMV.GFP.U6載體中，見圖2。

圖2重組pGCsil-shAkt2-GFP質粒測序鑒定

Fig 2Sequencing and identification of recombinant pGCsil-shAkt2-GFP plasmid

2.2RNAi對肺癌細胞H292Akt2基因表達的抑制作用GFP標記的病毒對照轉染細胞后48 h即可見較強熒光表達，轉染14 d后，仍見強GFP熒光表達(見圖3)。說明慢病毒載體高效、穩定的轉染效率。Western blot結果同樣顯示，Akt2蛋白表達明顯受到抑制。隨后我們使用流式細胞儀對轉染的細胞進行篩選，擴大培養1個月后得到穩定克隆，再次進行檢測，結果表明Akt2的表達明顯減少。

采用逐孔稀釋法測定病毒滴度，如圖3a為shAkt2慢病毒載體，圖3b為空載病毒載體。從上至下依次為病毒原液經倍比稀釋感染293T細胞后，明視野及熒光視野下觀察細胞GFP表達情況。熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少，所加病毒體積為10E1μl(10μl),10E0μl(1μl),10E-1μl(0.1μl)。

流式分選，培養皿繼續培養3天后分別在明視野、熒光視野下觀察細胞GFP熒光表達水平，病毒感染效率大于90%(見圖4)。Western blot分析三組細胞Akt2蛋白表達水平； 定量檢測各組蛋白條帶灰度值， 均以內參條帶灰度為參照物，比較各組Akt2蛋白表達水平，與H292及NC組比較，P<0.05，見圖5。

2.3Akt2對肺癌細胞H1299增殖的影響CCK-8法檢測穩定轉染細胞生長曲線(見圖6)，結果表明Ak2穩定抑制后對細胞增殖的影響呈時間依賴性。與對照組比較，shAkt2組細胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明顯減低(P<0.05)，干擾Akt2基因表達后顯著抑制細胞增殖速率。

圖3重組shAkt2慢病毒滴度測定

Fig 3Titer determination of recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2

圖4流式分選后各組細胞病毒感染率及GFP熒光表達水平

Fig 4Lentiviral infection rate and GFP fluorescence expression level of each group after fluorescence-activated cell sorting

圖5H292、NC及shAkt2組細胞Akt2蛋白表達水平的比較

Fig 5The Akt2 protein expression detected with Western blot Assay

2.4干擾Akt2表達對NSCLC 細胞凋亡的影響H292細胞株shAkt2組凋亡率顯著高于NC及NSCLC組(P<0.05)，而NC與NSCLC組相比，凋亡細胞比例基本一致，無統計學差異(P>0.05)。說明下調Akt2蛋白表達顯著促進NSCLC細胞凋亡，慢病毒表達載體對細胞凋亡無影響，見圖7。

圖6各組細胞生長曲線

Fig 6Growth curves of cells

注：與H292、NC組比較均①P<0.05

3討論

Akt2基因是Akt家族的重要亞型，已證實其激活后能磷酸化其下游多種底物，通過多種級聯反應參與調節腫瘤細胞生長、粘附、運動、侵襲和轉移，在腫瘤發生發展及化療耐藥中發揮重要作用[5-9]。慢病毒shRNA(小發夾RNA, short hairpin RNA)表達載體介導RNA干擾因其能夠感染廣泛的宿主細胞，穩定整合于靶細胞的基因組內，具有表達時間長、靶向性佳，不易誘發宿主免疫反應、安全性好等優點，而成為基因治療和基因功能研究的重要工具[10,11]。

莆等研究發現Akt2在NSCLC組織中過表達，且磷酸化Akt2表達陽性患者生存時間明顯短于表達陰性患者[4]。Miao 等[12]發現，Akt2的表達與NSCLC無病生存率和總的生存率相關，而與臨床病理學嚴重程度不相關；Balsara等[13]對肺癌病人的病理組織進行體外實驗，發現Akt2的過度活化對癌細胞局部浸潤發揮作用，體內實驗也表明，Akt2可以促進肺癌的粘膜下侵蝕和氣道內生長。Myoung等[14]應用siRNA技術抑制NSCLC細胞株Akt1、Akt2表達，發現抑制上述基因表達能增加NSCLC對順鉑治療的敏感性。提示Akt2可能參與NSCLC的發生發展，Akt2有望作為非小細胞肺癌早期診斷和基因治療的理想靶點。本研究中采用了腺癌細胞株H292，并發現，抑制Akt2蛋白表達能顯著抑制H292細胞株的增殖，說明在NSCLC中，Akt2是細胞增殖生長的重要調控因子。Lisa等[15]在對正常小鼠肌細胞及人成纖維細胞的實驗中發現Akt2主要參與調控細胞周期，對細胞增殖無作用。這與我們的結果不一致，我們推測，在正常細胞與腫瘤細胞中，Akt2調控細胞存活的方式不同。

為進一步研究Akt2影響H292細胞增殖、生長的途徑，我們采用流式細胞分析抑制Akt2基因表達后細胞凋亡的變化。結果發現，下調Akt2基因的表達， H292細胞的凋亡率顯著增加。我們推測，Akt2對細胞凋亡的作用是調控細胞增殖的重要環節。Yan等下調Akt2后神經膠質母細胞瘤的凋亡顯著增強[16]，這與我們的研究結果一致。

本研究表明，Akt2參與了調控H292細胞增殖和凋亡。但現有的研究沒有闡明Akt2在NSCLC體內的作用及機制，且Akt2及其信號通路是怎樣調節腫瘤細胞增殖和凋亡尚不清楚。因此，Akt2有望成為NSCLC靶向治療的候選靶點，但尚需要更深入地進行體內和體外研究。

圖7流式細胞分析各組細胞凋亡的水平

Fig 7Effects on apoptosis of each group detected with FACS

注：與H292及NC組比較①P<0.05

4結論

本研究方法獲得穩定干擾Akt2基因表達的NSCLC細胞克隆。在NSCLC中，靶向干擾Akt2基因表達抑制NSCLC細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡有望成為腫瘤治療的新靶點。

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(收稿日期：2015-09-06； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：李為民，教授，本刊副主編。E-mail：weimi003@yahoo.com

基金項目：國家自然科學基金(81372504)；四川省衛計委重點學科科研課題(150092)；川北醫學院科研發展計劃重點培育項目(CBYI3-A-ZP23)

【中圖分類號】R 373

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.006