PCR技術在類風濕性關節炎中的應用及其研究進展

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·綜述·

PCR技術在類風濕性關節炎中的應用及其研究進展

趙海歌1，丑廣程2，陳占良2，王建國2，段琳2綜述，王淑仙2△審校

(1.河北大學臨床醫學院研究生院，河北保定 071000；2.河北大學附屬醫院檢驗科，河北保定 071000)

關鍵詞:類風濕性關節炎；聚合酶鏈式反應；綜述

類風濕性關節炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，據不完全統計,我國有300萬人以上患有RA，其發病率為0.3%~0.6%。RA發病原因尚不清楚，現認為其發病原因有感染因素、遺傳因素和免疫因素，以慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現。RA診斷主要依靠臨床表現、X射線檢查及類風濕因子(RF)檢測。隨著免疫技術的不斷發展，許多自身抗體廣泛應用于RA的診斷，主要應用酶聯免疫法檢測抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKP)、抗環瓜氨酸抗體(抗CCP抗體)，以及其RF分型(IgG、IgM、IgA)。這些檢查可以提供早期診斷依據，提高患者疾病的治愈率。近年來隨著分子生物學技術的發展，可以直接從基因水平檢測疾病，提供更可靠的特異性的臨床診斷依據。

聚合酶鏈式反應(PCR)是體外擴增DNA的技術，它的研究已經有很長的發展歷史，1985年美國科學家申請了有關PCR的第一個專利，在science雜志上發表了第一篇PCR的學術論文，從此PCR技術得到了生命科學界的普遍認同。但是最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，但是Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變形時會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，這使操作程序更加復雜化。1988年初，有研究者改用T4 DNA聚合酶進行擴增，其擴增的產物具有均一性，但是每循環一次也需要重新加入酶。1988年有研究者提取出了TaqDNA酶，此酶耐高溫在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加入新酶，從而極大地提高了PCR擴增效率。在此之后，PCR方法不斷被改進，很多新技術不斷發展，比如具有3′→5′修復活性的熱穩定DNA聚合酶代替之前不具有3′→5′修復活性的DNA聚合酶。此外，在基礎原理上發展了新的技術，比如后來的反轉錄PCR、定量PCR及芯片PCR等新技術。本文就PCR技術在RA中的應用與發展做一簡單綜述。

1PCR-SSO反向雜交法和PCR-SSP法在RA中的應用

PCR-SSO即PCR序列特異性寡核苷酸擴增分析，其基本檢測原理是順序特異性寡核苷酸作為探針，用同位素或者是非放射性核素標記，然后與PCR擴增的目標產物片段雜交，根據陽性斑點判斷基因型。此種方法如果在基因型較多時需要數量較多的探針對每個DNA進行多次雜交，操作繁瑣，所以后來在此基礎上形成了PCR-SSO反向雜交技術，即將各種不同的探針固定于同一張陌上，再將PCR產物標記，以PCR產物(待測基因DNA)反過來與探針雜交。這樣一次即可完成多個等位基因分析，此種方法靈敏度高、特異度強、需要樣本量少。

PCR-SSP即PCR序列特異性引物，其基本檢測原理是設計出特異性引物，借助PCR獲得的特異性產物，可通過電泳分析帶型決定基因的型別，這極大地簡化了實驗操作步驟，簡單易行。PCR-SSO和PCR-SSP主要用于基因分型的研究，下面介紹這兩種方法在RA患者中的應用。

人類白細胞分化抗原(HLA)-DR4為RA的易感因素[1],HLA-DR4攜帶者在一些細小病毒等病原體感染時，可在短期內發展成RA，這較HLA-DR陰性者時間短，朱乃碩等[2]用PCR-SSO法研究發現RA患者HLA-DR4表達率要高于健康對照組。后來研究發現CD25和CD28等共刺激分子也可能與RA的發生、發展相關[3-4]。顧國浩等[5]用PCR-SSP研究發現HLA-DR4陽性的活動性RA患者的活動度明顯高于HLA-DR4陰性者,表現為C反應蛋白(CRP)顯著增高者高達78.6%,另外HLA-DR4陽性RA患者以IgG、IgA增高為主,而HLA-DR4陰性者則以IgM增高為主，提示HLA-DR4基因與RA發生、發展密切相關，這與朱乃碩等[2]的研究結果相似?；钚訲細胞,尤其是細胞毒性T細胞在RA的病理損傷中起重要作用,而共刺激分子CD28在T細胞特異性激活中是不可缺少的[6-7]，CD25是白細胞介素2受體α(IL-2Rα)分子,主要分布于活化T細胞、B細胞和巨噬細胞上,白細胞介素-2(IL-2)與之結合后發揮生物學活性。顧國浩等[5]研究發現活動性RA患者CD28+細胞百分比明顯低于健康對照組，提示CD28分子在RA的免疫失調和關節炎癥中起重要作用，活動性RA患者CD25+淋巴細胞明顯增高,表明患者淋巴細胞處于高度活化狀態[3],活動性RA患者CD25表達上升而CD28表達下降[4]。

通過以上幾種指標可以看出用這兩種方法可以從基因水平檢測與RA相關的因素但是這兩種方法各有優缺點。PCR-SSP和PCR-SSO在操作時標本需要量不多，但是需要大量的試劑，PCR-SSO在分析時檢測成本高，PCR-SSP在檢測時不易自動化，重復實驗需要重提DNA且必須使用紫外凝膠成像儀保留原始資料極大地增加了實驗成本。并且兩者在HLA基因分型時不能識別非經典的HLA,所以這些基因是否與RA有關需要進一步研究。

2差異顯示PCR在RA患者中的應用

高等動物在生命活動過程中，由于基因的選擇性表達、各種物理化學因素導致的突變及生理因素等會導致基因表達圖譜的差異。分析比較不同條件下基因表達差異能夠幫助了解組織分化發育及疾病的發生機制。

差異顯示PCR技術是將隨機引物和錨定cDNA的引物結合使用，利用一系列的oligo(dT)引物，逆轉錄真核生物細胞中全部表達的mRNA，通過PCR擴增的方法，轉換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因.

基因在不同組織細胞中的表達有差異，在細胞的不同階段和狀態中的表達也有差異，研究基因表達譜的變化有助于理解細胞分化、增生、細胞周期的調節和細胞衰老凋亡的過程。差異顯示PCR(DD-PCR)是一種以反轉錄PCR為基礎的研究基因表達差異的技術，可用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學研究，是篩選差異表達基因的有效方法。DD-PCR基本原理是取兩種從不同組織或細胞中分離出來的細胞質RNA或mRNA做為模板，利用可能的12種不同序列的寡核苷酸作為引物oligo(dT)進行逆轉錄，逆轉錄合成的12種互補DNA(cDNA)幾乎代表真核生物某一特定細胞中所有mRNA，通過PCR擴增的方法，轉換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。DD-PCR是篩選差異表達基因比較有效的方法之一。有研究者設計的第三代DD-PCR引物中,5′端引物為8種,3′引物仍為3種,它們的組合(共24組)將覆蓋所有的mRNA序列[8-9],利用DD-PCR對RA患者滑膜細胞基因進行分析。

王吉村等[10]用差示PCR技術檢測RA患者滑膜細胞中高表達基因發現，RA患者滑膜細胞高表達HSP70，并且這與Schett等[11]用免疫組化研究的結果一致,他們認為,這是由于在炎性因子或切力作用下,滑膜細胞細胞內熱休克蛋白因子-1的轉錄活性增高所致。王夏[12]用實時熒光定量PCR在研究內質網基因表達時發現非結構蛋白(UPR) 通路基因 ATF6，IRE1 表達水平與病程呈正相關。之前也有研究表明蛋白熱休克蛋白(HSPs)和 ER 伴侶分子如免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BIP)被證明能激發 B 和T 細胞免疫活性。在RA患者，滑膜組織內過度表達的 BIP 對滑膜 T 細胞有高度的選擇性[13-14]。同時研究者還用差示PCR技術檢測了RA患者體內的蛋白酶B基因，發現RA患者滑膜細胞高表達組織蛋白酶B的基因[10]。 這些研究結果都表明DD-PCR是篩選差異表達基因比較有效的方法之一。

3反轉錄PCR在RA患者中的應用

反轉錄PCR(RT-PCR)是一種以細胞內總RNA或者mRNA為材料進行體外擴增的技術。由于PCR中的耐熱的DNA酶(Taq酶)不能以RNA或mRNA為模板，所以首先要對RNA或mRNA進行反轉錄生成與之互補的cDNA，然后以cDNA為模板進行擴增。RNA、DNA印跡雜交技術、原位雜交組化的進行,提取RNA需標本劑量大、細胞數多,一般外周血需50 mL分離淋巴細胞方可提取RNA,進行RNA電泳后轉膜雜交。有研究者應用經典的RNA印跡雜交和RT-PCR兩種技術進行實驗,表明RT-PCR與RNA印跡方法完全具有可比性、相似性,認為RT-PCR是研究基因表達高效、敏感的方法,且所需RNA量極少。

林琳[15]用RT-PCR檢測RA患者外周血單個核細胞(PBMC)中白細胞介素-17A(IL-17A)mRNA的表達水平發現在RA患者PBMC中IL-17AmRNA 的表達水平明顯增高并與疾病活動程度呈正相關。有研究者在實驗中發現RA患者關節滑液中白細胞介素-17(IL-17)水平明顯高于骨性關節炎患者滑液中水平[16]。通過一系列細胞因子的作用,IL-17上調了Cyr61表達，參與慢性炎性反應[17-18],增強了RA關節的膠原破壞和重新合成、骨質的破壞及關節軟骨的破壞[19]。孟明等[20]研究表明RA患者外周血中iNKT細胞頻率與干擾素-γ(IFN-γ)/白細胞介素-4(IL-4)比值呈負相關。裴明等[21]用RT-PCR研究發現RA患者的滑膜中高度表達白細胞介素1受體拮抗劑(IL-1Ra)。這表明細胞因子在RA患者發病中起著重要作用，可以用RT-PCR準確高效地檢測出過度表達的異常相關基因，可分析mRNA是否異常及是否由其導致基因表達異常，可直接從基因水平顯示與RA的相關因素。

基于RT-PCR技術的原理，Yamamoto等[22]建立了一種分析T細胞克隆型的方法,即RT-PCR/單鏈構象多態性分析(SSCP)。SSCP可以檢測DNA序列之間的不同，進行DNA序列差異分析，在非變性條件下，單鏈DNA可自身折疊呈現一種由內部分子相互作用形成的三維構象，這種構象由單鏈DNA分子內的堿基順序決定，它影響了DNA在非變性凝膠中的遷移率。相同長度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝膠中的不同遷移率而被分離。遷移率不同的條帶可被銀染或者熒光標記引物檢測，然后用DNA自動測序進行分析。RT-PCR/SSCP法是根據不同T細胞受體(TCR)β鏈V區中CDR3堿基序列的不同,來分析T細胞克隆型。其不同于常用的在體外建立抗原特異性T細胞克隆后,再分析T細胞克隆型方法的優點是,即使在特異性抗原不明的情況下,也能直接分析體內聚集的T細胞克隆型。趙文明等[23]采用RT-PCR/SSCP法,比較分析一種自發性RA小鼠模型-SKG小鼠(發病初期與后期關節內聚集的T細胞克隆型的變化,結果顯示SKG小鼠自發性關節炎動物模型與TCR Vβ2和Vβ8.2的T細胞克隆型關系密切。此前有研究報道人的RA與TCR Vβ3、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型膠原蛋白誘導的大鼠RA模型與TCR Vβ8.2、Vβ4、Vβ17,Ⅱ型膠原蛋白誘導的小鼠RA模型與TCRVβ2、Vβ5、Vβ8 T細胞克隆型關系密切[24-25]。這些研究結果均顯示某些TCR Vβ型的T細胞與RA的發展密切相關。RA的自身抗原不明確，而RT-PCR/SSCP的主要優點就是在特異性抗原不明的情況下,也能直接分析體內聚集的T細胞克隆型，所以RT-PCR/SSCP很適合用于對RA患者的T細胞克隆分型分析。

4定量PCR在RA中的檢測應用

近年來定量PCR廣泛用于檢測RA患者中基因水平的異常。定量PCR有熒光定量PCR(FQ-PCR)又稱為實時PCR,還包括水解探針(TaqMan probe)技術、雜交探針技術、分子信標技術。

FQ-PCR的基本原理是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,在PCR反應體系中加入SYBR GreenⅠ染料，該染料能選擇性地摻入直雙連DNA分子中，并且產生強烈的熒光，熒光信號的檢測在每一個循環的延伸期完成后進行，其結合的熒光信號與DNA水平成正比。

焦志軍等[26]用定量PCR檢測RA患者外周血中單個核細胞Notch基因表達,結果顯示RA患者外周血中存在一群高表達Notch3的活化T細胞。之后焦志軍等[27]用流式細胞術和定量PCR技術，分別在蛋白質水平和mRNA表達水平檢測FoxP3表達，其研究結果顯示RA活動期時CD4+CD25+FoxP3+調節性T細胞明顯減少,這群調節性T細胞可能參與了RA病理進程。曹新國等[28]用套式實時定量PCR技術檢測外周血單核細胞中FOXP3+mRNA基因表達，發現CD4+CD25+T細胞數量與FOXP3+mRNA基因表達水平呈正相關。與此類似,Zappia等[29]在研究幼年型特發性關節炎(JIA)時也發現,患者外周血中CD4+CD25+數量少于健康人,而病情較輕或有自限傾向的患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞數相對較高且表達較多的FoxP3基因，這些結果表明T細胞在RA發病過程中具有重要病理作用，研究其具體作用機制對RA的病因研究和治療具有重要作用。荀春華等[30]用實時熒光定量PCR技術檢測miRNA-146a在RA患者外周血單個核細胞表達水平，并且同時用免疫法檢測血清CRP、RF、IL-17、 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，分析RA患者外周血單個核細胞miRNA-146a表達水平與血清CRP、RF、IL-17、TNF- α水平的相關性，結果顯示RA患者外周血單個核細胞的miRNA-146a高表達，且與血清CRP、IL-17、TNF- α水平呈明顯正相關。Kong等[31]的研究發現Sirt1 可以抑制核因子 κB(NF-κB)的轉錄活性，從而抑制炎性細胞因子的產生，如TNF-α，白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)等，丁永利等[32]用FQ- PCR檢測Ⅱ型膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)小鼠去乙?；?(Sirt1)、MMP-13、基質金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)mRNA的表達，同時用ELISA 檢測小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-4和白細胞介素-10(IL-10)的水平，結果發現在CIA小鼠中Sirt1過表達，并且過表達Sirt1的小鼠中血清細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17水平比對照組明顯降低，而IL-4水平升高,這與之前的研究相似,因此Sirt1可作為新的治療點，不過這有待于更多的研究。Lin等[33]也用FQ-PCR檢測RA患者外周血中單個核細胞誘騙受體 3(DcR3)mRNA的水平發現RA患者中DcR3mRNA的表達明顯高于健康者，DcR3 是一種可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員,可與腫瘤壞死因子配體 LIGHT、FasL 和 TLIA 競爭結合其相應的受體如 HVEM、Fas 和DcR3。不過由于DcR3 缺乏胞內區，不會傳導凋亡信號[34]。DcR3主要表現為抑制細胞凋亡，調節細胞生長、分化及免疫等作用，與多種疾病的發生和發展密切相關[35],結合研究結果表明DcR3在RA發生、發展中具有重要作用，可能通過抑制凋亡途徑進行，這有待于進一步研究。

FQ-PCR技術是近年來新發明的定量PCR技術，定量更準確并且具有更高的靈敏度和特異性，除此之外還有其他的優點：(1)通過顯示系統實時監測PCR的擴增過程；(2)反應完成后可直接得到實驗結果，無需打開反應管對產物進行電泳檢測，從而避免了開蓋檢測環節形成的氣溶膠對實驗室造成的污染。

5錯配PCR技術在RA患者中的應用

許多的研究表明IL-17A在RA的發病中具有重要作用，IL-17上調了Cyr61的表達，參與慢性炎性反應[15-18]。田輝等[36]通過錯配 PCR 技術提高人源化抗hIL17A 單鏈抗體(scFv)的親和力，為進一步開發治療RA的人源化抗體藥物奠定基礎。錯配PCR 技術是抗體體外親和力提高的一種可行性方法，在保證與抗原結合能力的基礎上提高了其親和力和中和活性。

細菌感染引起RA的原因一直備受關注，近年來檢測RA患者體內細菌內毒素的研究也越來越多，有研究發現RA患者體內存在葡萄球菌腸毒素e的基因，檢出率為13.25%[37]。

上述是PCR技術在RA中的應用，隨著PCR技術的不斷發展，精密度、特異度、靈敏度不斷提高，尤其是近年來廣泛應用的實時熒光定量PCR技術，可對異常表達基因實時定量檢測。通過PCR對RA患者基因表達的分析可以為RA的診斷和治療提供更可靠的依據，減輕RA患者的痛苦，達到早期診斷早期治療的目的。但是，上述研究只是針對RA患者基因方面的檢測，至于其具體臨床應用及其針對異常基因的藥物的研制還應繼續研究，并且其療效的好壞需要更多的臨床試驗證明。PCR技術不斷發展，每種技術具有各自的優缺點，在具體應用時應結合實際應用條件和目的選擇合適的方法。通過更多的研究進一步探討RA的發病機制和早期診斷方法，為RA的診斷、治療、預后提供更多、更可靠的依據。

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(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.027

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0643-04

作者簡介：趙海歌，女，在讀研究生，主要從事免疫學與分子生物學研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:15930229171@163.com。