基層醫院嗜血桿菌檢測方法及耐藥性的研究應用

梁建芬 綜述,吳開進 審校

(1.貴港市第二人民醫院檢驗科,廣西貴港 537132；2.玉林市紅十字醫院檢驗科，廣西玉林 537000)

·綜 述·

基層醫院嗜血桿菌檢測方法及耐藥性的研究應用

梁建芬1綜述,吳開進2審校

(1.貴港市第二人民醫院檢驗科,廣西貴港 537132；2.玉林市紅十字醫院檢驗科，廣西玉林 537000)

嗜血桿菌; 分離鑒定; 生物型; 抗菌藥物耐藥性

嗜血桿菌引起人類機會性感染致病越來越受到臨床關注，主要有流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae，HI)和副流感嗜血桿菌(hemophilus parainfluenzae，HPI)，國內對嗜血桿菌研究也有60年歷史。嗜血桿菌初次培養對營養要求高，在血平板上不生長或易被革蘭陽性球菌抑制，不易培養。在基層醫院由于缺乏可培養菌的分離培養條件，如專用培養基、CO2環境、人員業務水平所限而不能辨別菌落等因素影響，實驗室往往忽略嗜血桿菌分離而導致其檢出率極低，對其致病性、分布、分型及耐藥研究應用較少，本文就此作簡單的綜述。

1 嗜血桿菌檢測分離培養

1.1 直接涂片染色鏡檢 革蘭染色鏡檢對具有特殊形態的病原微生物檢查是一種快速有效的方法，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。對呼吸道原始標本進行革蘭染色，如鏡檢見短小呈絲狀體或線狀體陰性桿菌可初步懷疑為嗜血桿菌。由于嗜血桿菌本身就存在多形態特點，呈高度的異質性，抗菌藥物使用也會引起細菌變異，鏡檢出典型嗜血桿菌形態的幾率逐漸下降，因此，涂片檢查嗜血桿菌存在局限性。

1.2 選擇培養基分離 傳統使用普通巧克力平板分離嗜血桿菌的結果往往不太理想，許多改良的巧克力瓊脂培養基有效提高嗜血桿菌的分離率[1-2]。除了巧克力培養基外，國內已研制出不含巧克力的嗜血桿菌專用培養基(溫州市康泰生物科技有限公司生產)，更容易分辨嗜血桿菌生長菌落形態。基層醫院可根據成本核算情況購買成品，避免自制巧克力培養基質量難控問題，而市售巧克力平板的質量良莠不一，使用前需用標準菌株進行質量評價。選擇好培養平板后，將標本同時接種在血平板、嗜血桿菌培養基上，嚴格三區劃線，接種以保證長出單個菌落，置5%～10%CO2環境中(無CO2箱也可用稍大的燭缸代替)35 ℃培養24～48 h[3]。

1.3 鑒定 嗜血桿菌在血平板上不生長,巧克力平板上生長為無色或灰白色，圓形、透明、光滑、濕潤的菌落，革蘭染色為陰性短小桿菌。“衛星現象”可鑒別HI和HPI，在血平板上HI和HPI的“衛星現象”都能出現，用X因子和V因子紙片在M-H平板上，僅有HPI出現“衛星現象”。Barbe等[4]用API-NH鑒定條能準確鑒定絕大部分臨床分離的HI，API-NH鑒定試條是成熟的商品化試劑盒，因操作簡便而廣泛應用于臨床實驗室。API-NH不僅能快速鑒定細菌并可對嗜血桿菌進行生物分型，能夠滿足基層實驗室的要求。

2 嗜血桿菌分布

研究嗜血桿菌的分布，主要是了解嗜血桿菌的流行情況，為預防控制和治療感染提供臨床資料。嗜血桿菌的分布因研究對象和方法不同，結論不盡一致。陳東科等[5]研究發現嗜血桿菌分布與性別無關，而與寄生部位有關。張玉妥等[6]對健康人群中HI帶菌情況調查發現，不同年齡群口咽部HI帶菌率具有明顯差異，學齡前兒童、學齡兒童、成人HI檢出率分別為39.8%、20.7%、7.0%，年齡越小帶菌率越高，高帶菌率人群會成為HI感染的高危人群。王冬國等[7]調查兒科住院患者嗜血桿菌分布結果，年齡在4月至2歲的患兒有2/3以上能夠檢出HI或HPI，并且HPI的檢出率也逐步升高，帶菌率表明兒科住院患者必須切實控制呼吸道感染的傳播。吳開進等[8]報道318例重癥手足口病兒童細菌分離狀況，其中嗜血桿菌的分離率為20.1%。目前基層醫院對嗜血桿菌分布的研究資料不多，因此，有必要積極開展相關研究工作，有利于基層醫院對嗜血桿菌感染的預防控制和治療提供制定策略依據。

3 嗜血桿菌分型

正確的分型是嗜血桿菌致病性和流行調查研究基礎，通常有以下幾種方法:血清學分型，生物分型法，外膜蛋白分型，基因分型等。血清學分型的特點為快速簡便,其局限性在于莢膜多糖抗原抗原性較弱,較難制備高特異性的抗血清，不易推廣；外膜蛋白分型，基因分型等分型方法雖然有較好的前景，但受限于常規實驗室條件，目前基層醫院仍難以普及。生物分型方法簡單，并且試劑商品化，是一種比較經典的方法，根據嗜血桿菌對吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3個生化反應不同，嗜血桿菌被分為生物型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ8個型。1982年Holmes等[9]用API 20E可以對HI進行生物分型。Landgraf等[10]在對1 015份腦脊液分離的HI進行生物學分型研究中，Ⅰ型占70.9%，Ⅱ型占27.5%。賴國祥等[11]報道兒童感染組和健康組咽拭子分離的鼻咽部HI學齡前組生物分型均以Ⅵ型(分別為37.5%和61.1%)占優勢,學齡組則均以Ⅰ型(分別為25.0%和41.2%)占優勢,與解靜平等[12]報道的肺炎患兒分離株和健康兒童咽拭子培養株均以Ⅱ型為主(分別占49%和45%)不同。有研究資料表明，兒童攜帶的HI有致病的傾向，致病菌株以HI血清b型為主，生物學分型和血清型與HI疾病有一定的關系[13-15]。基層醫院采用簡易的生物分型方法是值得推廣。

4 嗜血桿菌耐藥性

嗜血桿菌耐藥性在國外研究得比較早，1972年歐洲首次發現HI對氨芐西林耐藥之后，在世界各地相繼被報告，并有逐年上升趨勢，Kohno等[16]對HI作一項全球性抗菌藥物耐藥監測調查，結果顯示HI耐藥率在不同國家差別較大，最低意大利為1.8%，韓國為64.7%。國內研究和報道最多的也是HI對氨芐西林耐藥性,2002年楊永弘等[17]監測HI對氨芐西林的平均耐藥率為9.6%(4.8%～14.4%)，2010年Mohnarin報告HI對氨芐西林的耐藥率上升至45.0%[18]。HI對氨芐西林耐藥率在感染患者年齡也有差異，CHINET 2010年監測顯示兒童分離的HI對氨芐西林的耐藥率為35.1%[19]。HI對氨芐西林的耐藥機制，除了細菌產生β-內酰胺酶所致外，部份β-內酰胺酶陰性流感嗜血桿菌株也出現對氨芐西林耐藥狀況，主要是菌株細胞壁上一種或多種青霉素結合蛋白發生改變，引起青霉素結合蛋白與靶位親和力降低，其次是外膜蛋白改變導致耐藥[20]，這些新耐藥機制出現給臨床選擇抗菌素帶來挑戰。

HI對四環素、復方磺胺甲惡唑的耐藥率較高，有資料表明HI對這兩種抗菌素的耐藥是HI基因突變所致[20]。CHINET 2010年監測HI對頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟耐藥率分別為2.3%、20.8%、15.2%[19]。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，HPI耐藥率也不斷增加。有報道HPI對氨芐西林為42.5%～65.2%[18，21]，HPI對氨芐西林的耐藥性主要與產生β-內酰胺酶有關，其機制由質粒介導，部分為質粒接合子，并攜帶完整的TnA型轉座子及其他耐藥基因；國內報道從兒童分離的HPI產酶率差異也大，最高報道為37.8%[22]，產酶株的增加也是導致HPI出現多重耐藥性的重要因素。

5 結束語

隨著微生物檢驗技術快速的發展，一些半自動或全自動的微生物鑒定儀器和藥敏分析系統在基層醫院得到應用，使微生物檢測變得簡易、快捷。因此，除了完成常見的簡單的鑒定藥敏報告外，基層醫院加強苛養菌的培養及其耐藥性監測研究是細菌學常規檢驗一種要求。

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梁建芬，女，主管檢驗師，主要從事微生物檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.030

A 文章編號：1673-4130(2016)07-0946-03

2015-10-11)