維生素K2抑制肝癌細胞增殖的機制研究

王光麗　周小輝

維生素K2抑制肝癌細胞增殖的機制研究

王光麗周小輝

【摘要】目的探討維生素K2抑制肝癌細胞(HCC)增殖的可能機制。方法人肝癌細胞株(HuH7)傳代培養，以不同濃度的(0、10、30 μM)維生素K2處理HuH-7細胞96 h，以實時定量PCR測定和Western印跡分析分別測定血小板衍生因子α受體(PDGFR-α)mRNA和蛋白的表達；用pluc-a2(PDGFRα啟動子熒光素酶載體)轉染人肝癌細胞株(HepG2)，用維生素K2處理24 h后采用熒光素酶測定其熒光活性。結果維生素K2抑制HuH7細胞的增殖；維生素K2以劑量依賴的方式抑制PDGFR-α mRNA和蛋白的表達；PDGFR-α啟動子的活性被維生素K2抑制并呈劑量依賴關系。結論維生素K2可能通過下調PDGFR-α的轉錄抑制肝癌細胞的增殖。

【關鍵詞】維生素K2；肝癌細胞；血小板衍生因子α受體

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:014～017)

肝細胞癌(HCC)是最常見惡性腫瘤之一。在癌癥相關的死亡中，肝癌居于第3位[1-2]。到目前為止，包括肝內注射給藥在內的密集化療已被應用于晚期肝細胞癌的治療。然而，由于復發率高及癌組織對門靜脈的侵襲，患者的愈后并不樂觀[3-4]。

維生素K是1種脂溶性維生素，屬于結構相似的2-甲基-1，4萘醌親脂家族，該家族包括維生素K1、K2和K3[4-5]。迄今為止，維生素K2在日本被廣泛應用于骨質疏松癥的治療，無明顯副作用[4]。最近的研究發現，維生素K2在體內外均能抑制包括肝癌細胞在內的眾多腫瘤細胞的增殖[1,3,6]。另一項臨床研究表明，維生素K2預防了病毒性肝硬化導致的肝細胞癌的發生[7]。然而，維生素K2抑制肝癌增殖的機制尚不明確。血小板衍生因子受體α(PDGFRα)與配體結合后，便處于激活狀態，能引起細胞內特異性底物的磷酸化，這些底物屬于受體酪氨酸激酶家族[8-9]。在基底細胞癌、腦腫瘤、胃腸道間質瘤等多種腫瘤組織中，PDGFR-α的表達明顯升高。近期的一項研究發現，與癌旁組織比較，肝癌組織中PDGFR-α的表達也是升高的。小鼠體內高表達肝特異性的PDGFR-α配體PDGF-CC，逐步進展為肝硬化與肝癌[10]。抗PDGFR-α單克隆抗體具有抑制多種人與小鼠來源的腫瘤細胞的增殖，其中包括肝細胞癌的細胞系[2]。根據上述研究結果，我們假設PDGFR-α可能在肝癌的進展中發揮重要作用，抑制PDGFR-α可能對于肝癌治療是有意義的。既往研究顯示維生素K2處理肝癌細胞(HepG2)后，采用基因芯片技術測定發現PDGFR-α的表達是下降的[11]。那么維生素K2抗腫瘤增殖的作用，是否可能通過抑制PDGFRα的表達實現的？

1材料與方法

1.1　材料

肝癌細胞系HuH7與HepG2(ATCC),DMEM培養基(GIBCO公司,美國)，胎牛血清(Signa公司，美國)，維生素K2(Eisai公司，日本)，MTT(Roche公司,美國)，PDGFR-α 與β-actin抗體(Santa Cruz公司，美國)，磷酸鈣轉染試劑盒(Invitrgen公司，美國)，熒光素酶測定試劑盒(Promega公司，美國)，RNA提取試劑盒(Nakalai Tesque公司，日本)，逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce公司，美國)，ABC試劑盒(Vector,Burlingame,美國)。包含PDGFR-α啟動子區域的質粒pluc-a2由日本兵庫大學醫學院的Yutaka Kitami教授饋贈。維生素K2來自日本Eilai公司，以酒清作為溶劑，配制不同濃度的維生素K2儲液(0.01,0.1,1,10,30 mM)，然后用DMEM-10%胎牛血清(FBS)稀釋至工作液的乙醇濃度3‰。

1.2　方法

1.2.1細胞培養人肝腫瘤細胞HuH7與HepG2均用DMEM培養基培養，加入10%胎牛血清(FBS)，青霉素(100 U/ml),鏈霉素(100 mg/ml)，在37 ℃含5%CO2飽和濕度的細胞孵育箱中培養。細胞融合達80%以上時，用胰酶(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化傳代。細胞經不同濃度的維生素K2處理96 h后，用于后續實驗。對照組細胞加入與實驗組終濃度相同的酒精。HuH7用于MTT、熒光定量PCR和western blot，HepG2細胞用于熒光素酶測定實驗。

1.2.2四氮唑藍比色分析法(MTT比色法)取對數生長的HuH7細胞接種于96孔板中，細胞密度為2.5×103/孔，加入100 μl培養基。細胞貼壁后，加入含有不同濃度維生素K2(0.01,0.1,0,1,10,30 μM)的新鮮培養基。細胞孵育48、72及96 h后，加入MTT1液繼續孵育4 h，每孔中加入100 μl溶劑DMSO，選擇單波測定(540 nm)，采用酶聯免疫檢測儀測定每孔的光密度值，并將OD測定值轉換為相應細胞數予以計算。

1.2.3實時熒光定量RT-PCR采用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7細胞96 h后，按照試劑盒說明(Nakalai Tesque,Kyoto,Japan) 提取細胞總RNA，濃度調整為0.5 μg/μl。用分光光度計，在260 nm與280 nm處分別測定RNA樣本的吸光度值。A260/A280 1.8的樣本中提取1 μg總RNA進行RT-PCR。20 μl PCR反應體系中加入1 μl cDNA，終濃度為0.2 μM的上游與下游引物，混勻，4 000 rmp瞬間離心，20 ℃反應10 min,37 ℃反應120 min,85 ℃反應5 S,4 ℃反應5 min結束，逆轉錄產物進行實時定量PCR。基因表達水平用ABI PRISM 7700序列測定系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)根據說明書來檢測。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃30 s，循環40次。引物序列如下：PDGFR-α 上游:5'-GACCCTATGCAGCTGCCTTA-3',下游:5'-GGAAGCTACCCTATTCTTATG-3';β-actin上游:5'-CCTAGAAGCATT TGCGGTGG-3',下游:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'。條帶的強度用光密度分析儀定量測定，并與參照物β-actin條帶結果比對分析。

1.2.4Western bolt用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7細胞96 h后，用預冷的PBS洗2次，加入裂解液冰上裂解(1×PBS,1% NP-40,0.5%去氧膽酸鈉,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,45 μg/mL抑肽酶,100 mM原釩酸鈉)。離心后收集上清，BCA法測定各樣本蛋白濃度，調整上樣量一致，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h。加入化學發光液，暗室中顯影，用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白條帶的灰度值與本組actin的灰度值相除，對所得數值進行統計學處理。

1.2.5瞬時轉染與熒光素酶測定PDGFR-α啟動子報告基因的結構如圖1所示。HepG2細胞接種于直徑為35 mm的培養皿中，細胞密度為5×103/孔，用含5%FBS-CCS的不含酚紅的DMEM培養。細胞用4 μg Pluc-a2轉染,同時用0.1 μg of PRL-TK轉染，后者用于矯正轉染效率。轉染24 h后，培養基更換為含不同濃度(0,10和30 μM)維生素K2的新鮮培養基，孵育24 h，測定細胞裂解液中熒光素酶的活性。

圖1　PDGFR-α啟動子報告基因的結構

1.3　統計學處理

2結果

2.1　維生素K2對細胞增殖的作用

前期研究發現，維生素K2能以劑量依賴的方式抑制HepG2細胞的增殖[4]。與此相符，維生素K2也能抑制HuH7細胞的增殖。在HuH7細胞中，與對照組相比，10與30 μM的維生素K2分別抑制細胞增殖的比例為48.9%與65.7% (P<0.05)。基于此發現，我們選擇10與30 μM作為進一步研究的藥物濃度。

2.2　維生素K2對PDGFR-α mRNA表達的影響

為了探討維生素K2抑制HuH7細胞增殖的分子機制，以及了解PDGFR-α是否在此過程中發揮作用，我們采用不同濃度的維生素K2(0,10和30 μM)處理HuH7肝癌細胞96 h后，用實時定量PCR檢測不同組PDGFR-α mRNA的表達。如圖2所示，與對照組相比，10與30 μM的維生素K2處理的細胞中PDGFR-α mRNA的表達分別減少了(0.65±0.37)和(0.94±0.05)(P<0.01)。維生素K2以劑量依賴的方式抑制PDGFR-α mRNA的表達。

圖2　維生素K2對PDGFR-α mRNA表達的影響

2.3　維生素K2對PDGFR-α蛋白表達的影響

用不同濃度維生素K2處理細胞96 h后，western blot檢測不同組PDGFR-α蛋白的表達，用Quantity One軟件測定條帶的灰度值。如圖3所示，維生素K2顯著抑制PDGFR-α蛋白的表達。10 和 30 μM濃度的維生素K2處理組細胞內PDGFR-α的蛋白表達水平分別為對照組的(0.53±0.03)和(0.57±0.05)倍(P<0.05)。由此可見，維生素K2不僅抑制PDGFR-α mRNA，同時也抑制蛋白的表達。隨后，我們檢測維生素K2是否也在轉錄水平抑制PDGFR-α的表達。

圖3　維生素K2對PDGFR-α蛋白表達的影響

2.4　維生素K2對PDGFR-α啟動子活性的影響

熒光素酶實驗用于檢測維生素K2對PDGFR-α啟動子區域活性的作用。PDGFR-α報告基因質粒瞬時轉染HuH7細胞，隨后檢測熒光素酶的活性。如圖4所示，10和30 μM濃度的維生素K2處理組細胞內PDGFR-α的熒光素酶相對活性分別為對照組的(0.75±0.12)和 (0.49±0.38)(P<0.05)。維生素K2抑制了PDGFR-α啟動子活性。

圖4　維生素K2對PDGFR-α轉錄的影響

3　討論

研究發現，維生素K2具有抑制肝癌細胞增殖的作用[4,8]。與此相符，我們的研究表明，用維生素K2處理細胞96 h后，HuH7細胞的增殖以維生素K2劑量依賴的方式受到抑制。當用10 μM的維生素K2處理細胞時，細胞的數量明顯減少。細胞數量的減少是由于增殖受到抑制，而不是細胞死亡。因為，在鏡下并未觀察到培養基中存在大量死亡細胞的現象。到目前為止，維生素K2抑制肝癌增殖的機制并不明確。

PDGFR是特異的蛋白酪氨酸激酶細胞表面受體，有2種亞型，即PDGFR-α和-β。在PDGFR與其相應的配體結合后，信號轉導通路便被激活[12]。在生長發育過程中，PDGFR-α在許多組織中發揮作用，它參與增殖、形態發生、上皮與間質的相互作用[11,13]。近期的一項研究發現，PDGFR-α僅在惡性程度高的肝細胞腫瘤組織的內皮中高表達[10]。另有研究發現，以PDGFR-α為靶向的單克隆抗體處理人與小鼠肝癌細胞，能有效地抑制PDGFR-α的表達和細胞的增殖與轉移；同樣的，肝癌小鼠模型中的研究也表明，此單克隆抗體還能延長肝癌小鼠的生存期[2]。基于上述研究結果，我們可以做出假設：PDGFR-α可能參與維生素K2抑制肝癌增殖的機制。我們既往的研究發現，維生素K2能減少PDGFR-α的表達。

在本研究中，我們檢測了維生素K2對PDGFR-α mRNA與蛋白表達，以及對PDGFR-α啟動子區活性的影響。首先，用實時定量PCR的方法檢測PDGFR-α mRNA的表達。結果表明，用不同濃度的維生素K2處理細胞96 h后，隨著維生素K2的濃度增加，PDGFR-α的表達逐漸減少。隨后，我們用western blot的方法檢測PDGFR-α蛋白的表達，結果與實時定量PCR的結果相符，PDGFR-α的表達以維生素K2劑量依賴的方式減少。以上研究結果表明，維生素K2能同時抑制PDGFR-α mRNA與蛋白的表達。然而，我們并不知道維生素K2的抑制作用是否因為其與PDGFR-α的啟動子相互作用所致。最后，我們用瞬時轉染與熒光素酶報告基因的方法，檢測維生素K2對PDGFR-α啟動子活性的影響。研究發現，隨著維生素K2的濃度增加，PDGFR-α的活性逐漸減弱。

越來越多的研究表明，PDGF信號通路與幾種病理狀態相關，其中包含了纖維變性疾病，如肺纖維化、肝纖維化、硬皮病等[14]。近期的一項研究發現，過度表達PDGFR-α的一種配體PDGFR-C能導致肝纖維化，后者是由于膠原沉積于細胞外周與靜脈周圍形成的病理改變[15]。我們推測維生素K2可能通過抑制PDGFR-α的表達改善肝硬化。維生素K2改善肝纖維化的作用機理以及PDGFR在此過程中的作用，還有待進一步研究。然而，我們的研究為維生素K2抑制肝癌增殖的作用提供了依據，可能的分子機制是維生素K2抑制了PDGFR-α的表達。維生素K2可能成為肝細胞癌的潛在治療劑。

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(編輯：吳小紅)

Mechanisms of Vitamin K2 on Suppression of Proliferation of Hepatocellular Carcinoma

WANGGuangli,ZHOUXiaohui.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou,515041

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of inhibition proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines in vitro.MethodsHuman hepatoma cells (HuH7) were treated with various concentrations of vitamin K2 for 96 h,then the expression of PDGFR-α mRNA and protein was investigated by real time PCR and western blot analysis respectively.human hepatoma cells (HepG2) were transfected with pluc-a2 (PDGFR-α promoter-luciferase vector),and the luciferase activity after 24 h treatment with Vitamin K2 was assessed.ResultsVitamin K2 suppressed the expression of PDGFR-α mRNA and protein in a dose dependent manner.The PDGFR-α promoter activity was suppressed by Vitamin K2 administration in a dose dependent manner.ConclusionVitamin K2 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via down-regulating the transcription of PDGFR-α.

【Key words】Vitamin K2；Human hepatoma cells；Platelet-derived growth factor receptor-α

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0014-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.005

通訊作者：周小輝

基金項目：作者單位:515041 汕頭大學醫學院第一附屬醫院

收稿日期(2015-01-01修回日期 2015-04-22)